RICERCA ITALIANA     

IDENTIFICAZIONE DELLA FUNZIONE DI GENI CODIFICANTI NUOVI TRASPORTATORI MITOCONDRIALI: OVER-ESPRESSIONE, CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE E RUOLO FISIOLOGICO

Università degli Studi di Bari

Abstract

Negli anni '80-'90, la determinazione della struttura primaria dei primi 6 trasportatori (carrier) mitocondriali che sono stati identificati ha portato al riconoscimento di caratteristiche comuni nella loro sequenza e quindi al concetto dell'esistenza di una famiglia proteica di carrier mitocondriali. Con il sequenziamento del DNA genomico di vari organismi sono emerse centinaia di geni (proteine) con le caratteristiche di sequenza della famiglia dei carrier mitocondriali (di cui non si conosce la funzione). Il genoma di Saccharomyces cerevisiae, per esempio, contiene 35 geni codificanti possibili membri della famiglia dei carrier mitocondriali, il genoma di Arabidopsis 58, e il genoma umano circa 60. La funzione della maggior parte di questi geni è ancora sconosciuta.

Per identificare la funzione dei geni codificanti nuovi carrier mitocondriali (dal lievito all'uomo), utilizzeremo una strategia che è stata già da noi adottata con successo e che consiste nelle seguenti tappe: 1) ricerca nelle banche dati dei geni codificanti possibili carrier mitocondriali; 2) amplificazione dei geni codificanti carrier mitocondriali; 3) clonaggio di questi geni in vettori di espressione ed espressione dei prodotti genici in E. coli, S. cerevisiae o Lactococcus lactis; 4) purificazione delle proteine codificanti con una coda di istidine (o un'altra opportuna coda); 5) incorporazione delle proteine purificate in vescicole lipidiche (liposomi); 6 >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Ferdinando Palmieri Università degli Studi di BARI

Obiettivo del Programma di Ricerca

Gli obiettivi finali che il progetto si propone di raggiungere sono:

1) L'identificazione della funzione dei geni codificanti nuovi membri della famiglia dei carrier mitocondriali in vari organismi (dal livito all'uomo): almeno 4 geni codificanti nuovi carrier mitocondriali (esclusi gli ortologhi), presumibilmente 2 di lievito e 2 umani. Questo obiettivo sarà raggiunto utilizzando una strategia che è stata già da noi adottata con successo e che consiste nell'espressione del gene in esame in E. coli, S. cerevisiae o L. lactis, purificazione e incorporazione del prodotto genico nei liposomi, e identificazione della sua funzione mediante misure delle attività di trasporto di specifici substrati (metaboliti, nucleotidi o cofattori) nei proteoliposomi. Per la scelta del substrato da saggiare nei proteoliposomi utilizzeremo le conoscenze sulla distribuzione subcellulare degli enzimi delle vie metaboliche note, le eventuali informazioni genetiche sui singoli geni e strumenti bioinformatici (alberi filogenetici, ecc.). Buoni candidati da essere identificati sono le proteine di uomo Q96CQ1, Q9BSK2, XM_941892.2 e NP_848621.1, le proteine di S. cerevisiae codificate dai geni YMR241w, YPR011c, YBR104w e YPR058w, e le proteine di Arabidopsis codificate da At1g25380, At2g47490 e At4g01100.
L'identificazione di nuovi carrier mitocondriali porterà alla luce l'esistenza e l'importanza di reazioni di trasporto, localizzate nella membrana >>>

Risultati parziali attesi

Sulla base della nostra esperienza nel campo e dei risultati già ottenuti (vedi sezione 12), si prevede di identificare, nel corso di questo progetto, la funzione di almeno 4 geni codificanti nuovi carrier mitocondriali (almeno 2 in S. cerevisiae e almeno 2 nell'uomo), escluse le isoforme. Buoni candidati da essere identificati sono le proteine di uomo Q96CQ1, Q9BSK2, XM_941892.2 e NP_848621.1, le proteine di S. cerevisiae codificate dai geni YMR241w, YPR011c, YBR104w e YPR058w, e le proteine di Arabidopsis codificate dai geni At1g25380, At2g47490 e At4g01100. Ogni prodotto genico sarà caratterizzato in termini di specificità di substrato (il metabolita o i metaboliti che esso specificamente trasporta), dei parametri cinetici, ecc. Inoltre, si prevede di comprendere il ruolo fisiologico di ogni prodotto genico (carrier mitocondriale) nel metabolismo cellulare.

I membri della famiglia dei carrier mitocondriali trasportano un gran numero di substrati diversi, dal H+ a nucleotidi e a cofattori. Quindi, l'approccio genomico allo studio di questa famiglia di proteine, che noi proponiamo, porterà a nuove informazioni che avranno un impatto significativo sull'avanzamento delle conoscenze. In particolare, l'identificazione di nuovi carrier mitocondriali porterà alla luce l'esistenza e l'importanza di reazioni di trasporto, localizzate nella membrana mitocondriale, non ancora note o solo supposte. Questa informazione completerà la >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

I trasportatori o carrier mitocondriali sono una famiglia di proteine, codificate dal DNA nucleare, che sono localizzate, con alcune eccezioni, nella membrana interna dei mitocondri (1-3 per reviews). La loro comune funzione è quella di collegare il citosol e i mitocondri catalizzando il passaggio selettivo di molti soluti (metaboliti, nucleotidi e cofattori) attraverso la membrana mitocondriale. Questo flusso di soluti è indispensabile, perché molte vie metaboliche richiedono la partecipazione di reazioni enzimatiche sia intra- che extramitocondriali.

Nel passato sono stati purificati 11 carrier mitocondriali (ref. 4 per una review). Di questi solo 6 (2 nel nostro laboratorio) sono stati clonati e sequenziati (5-10). I 6 carrier prima purificati e poi sequenziati trasportano, rispettivamente, ADP/ATP, fosfato, oxoglutarato, citrato, carnitina/acilcarnitine e H+. La caratterizzazione molecolare di questi trasportatori ha dimostrato che essi appartengono alla stessa famiglia di proteine (1-4 per reviews). Infatti, essi hanno una struttura tripartita, costituita da 3 domini ripetuti di circa 100 aminoacidi, e ogni dominio contiene due segmenti idrofobici ed il motivo di sequenza P-X-D/E-X-X-K/R-X-R/K.

Nell'era genomica, con la disponibilità delle banche-dati di DNA (e proteine), è diventato possibile utilizzare le caratteristiche di sequenza della famiglia dei carrier mitocondriali per cercare probabili membri della stessa famiglia, la cui >>>