RICERCA ITALIANA     

DINAMICA DELL'INTERAZIONE RIBOSOMI-LIGANDI DURANTE L'INIZIO DELLA TRADUZIONE NEI BATTERI E NEGLI ARCHEI

Università degli Studi di Camerino

Abstract

In tutti gli organismi viventi l'inizio rappresenta una tappa essenziale della sintesi proteica, essendo la fase del processo di traduzione del messaggio genetico durante la quale viene a) selezionato il corretto codone d'inizio dell'mRNA, fissando così la cornice di lettura per il decoding e b) determinato, termodinamicamente e cineticamente, il livello di espressione traduzionale di ciascun mRNA. Nel processo d'inizio intervengono in momenti diversi e con ruoli diversi le due subunità ribosomali ed alcuni specifici ligandi delle stesse (fattori d'inizio, tRNA d'inizio ed una particolare regione del mRNA indicata come translation initiation region o TIR). Tuttavia, nonostante il processo d'inizio sia conservato evolutivamente nei suoi aspetti fondamentali, il numero e la complessità dei componenti che interagiscono durante la reazione d'inizio variano in funzione del dominio cellulare, essendo molto maggiore negli eucarioti e negli archei rispetto ai batteri.
E' noto che i movimenti del tRNA d'inizio e dell'mRNA che conducono alla formazione di un complesso d'inizio produttivo (70S nei batteri e negli archei) richedono l'azione coordinata dei fattori d'inizio, la quale si esplica attraverso reciproche interazioni, che avvengono alla superficie dei ribosomi coinvolgendo i fattori stessi, gli altri ligandi ed alcuni componenti intrinseci del ribosoma. Pertanto la descrizione esaustiva di tali >>>

Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca

Claudio Gualerzi Università degli Studi di CAMERINO

Obiettivo del Programma di Ricerca

Utilizzando tecniche innovative quali analisi cinetiche rapide e probing chimico in tempo reale, oltre a metodologie classiche di biologia molecolare, questo programma si propone di raggiungere i seguenti specifici obiettivi finali:
(a) ottenere un quadro dettagliato della dinamica dell'interazione dei fattori IF1, IF2 ed IF3 (batterici) e dei fattori aIF1, aIF1A e aIF2/5B (archeali) con le subunità ribosomali omologhe e/o con altri componenti del sistema d'inizio della traduzione;
(b) delucidare, nei batteri, gli aspetti meccanicistici dell’interazione tra IF2 ed fMet-tRNA in rapporto al meccanismo di formazione dei complessi d’inizio 30S e 70S e di dissociazione di IF2 dal complesso d'inizio 70S;
(c) definire le sinergie fra i fattori archeali aIF1, aIF1A e aIF2/5B nel promuovere la formazione dei complessi d'inizio 30S e 70S;
(d) determinare se esista o meno un'interazione tra met-tRNAi e l'omologo archeale (aIF2/5B) di IF2 batterico ed eventualmente determinarne le caratteristiche topografiche e cinetiche;
(e) determinare se aIF2/5B archeale sia in grado o meno di stimolare l'associazione fra subunità ribosomali come sembra essere il caso del suo omologo eucariotica (eIF5B) e batterico (IF2);
(f) stabilire quali siano le basi molecolari della discriminazione nei confronti di complessi d'inizio "anomali" operata da IF3 nei batteri;
(g) determinare quale proteina degli Archei >>>

Risultati parziali attesi

I risultati della collaborazione fra i due laboratori impegnati in questo programma forniranno risposte precise ad alcuni problemi aperti riguardanti il meccanismo d’inizio della traduzione nei batteri e negli archei. Ci attendiamo che questi risultati producano un avanzamento significativo nelle conoscenze disponibili sulla dinamica e l’evoluzione di questo processo cellulare fondamentale.

Nel dettaglio, i risultati attesi e il loro significato specifico e generale sono di seguito elencati.

1) Per quanto riguarda i sistemi batterici, ci attendiamo di trovare risposte puntuali ai seguenti quesiti:

a) In quale momento del pathway dell'inizio della traduzione vengono dissociati dai ribosomi i fattori IF1 ed IF3?
b) Quali sono le costanti cinetiche di formazione e dissociazione e di equilibrio dei complessi tra le subunità ribosomali ed i loro ligandi ed in quale maniera tali costanti sono influenzate dalla presenza degli altri ligandi?
c) Il tRNA iniziatore fMet-tRNA viene portato sul ribosoma da IF2 che agisce da carrier o viene reclutato dal fattore mentre quest'ultimo si trova già legato alla subunità 30S?
d) Qual è la base molecolare della discriminazione operata da IF3 nei confronti dei complessi d'inizio “non-canonici”?
e) Come si lega il fattore IF1 alla subunità 30S? Entra direttamente nel suo sito (vicino al sito A della subunità 30S) o percorre una via particolare alla superficie >>>

Durata

24 mesi

Base di partenza scientifica nazionale o internazionale

Lo studio della struttura, funzione, sintesi ed assemblaggio dei ribosomi, le particelle ribonucleoproteiche responsabili della sintesi delle proteine in tutti i tipi di cellule, ha rappresentato uno dei più importanti capitoli della biologia molecolare. Gli straordinari successi ottenuti negli ultimissimi anni dalla biologia strutturale, che hanno condotto all’elucidazione, a livello atomico, della struttura 3D di entrambe le subunità ribosomali batteriche, oltre ad aver permesso di comprendere e razionalizzare un’enorme massa di risultati sperimentali accumulati nel corso di decenni, hanno stimolato ricerche sempre più avanzate e focalizzate ad una vera e profonda comprensione del meccanismi molecolari che consentono la selezione e decodificazione del messaggio genetico, la formazione dei legami peptidici, la sintesi, il folding co-traduzionale ed il “targeting” delle proteine prodotte (1-3). Tutto ciò ha fatto sì che il ribosoma, la struttura subcellulare più complessa (>50 proteine e ca. 4700 nucleotidi di rRNA, per una massa di ca. 2.5 MDa in E. coli) e conservata nel corso dell’evoluzione, essendo già presente in LUCA, il “Last Universal Common Ancestor”, sia anche divenuto negli ultimi anni la “macchina” cellulare i cui “ingranaggi” e meccanismi sono meglio compresi. La dimostrazione che il ribosoma rappresenta un gigantesco “ribozima” ed il rafforzamento, da essa derivante, dell’ipotesi ”RNA World” che identifica nell’RNA la prima macromolecola informazionale >>>