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Risultati Preliminari.20-36 Simoni et al. (J. Med. Chem. 1997, 40, 3581; Med. Chem. Res. 1998, 8, 291; J. Med. Chem. 1999, 42, 4961) hanno iniziato uno studio volto alla progettazione di retinoidi dotati di potente attività apoptotica e selettività verso cellule neoplastiche. E' stato così osservato che arotinoidi isossazolici portanti la stereochimica cis alla funzionalità olefinica erano migliori induttori di apoptosi rispetto agli isomeri trans. E' stato scoperto anche che il cis-TTNPB, un composto che mantiene alcune caratteristiche strutturali del 9-cis-RA, possiede potente attività apoptotica, mentre l'isomero trans ha solo effetti moderati nella inibizione della proliferazione cellulare. In aggiunta, retinoidi analoghi al TTNPB con gruppo amminico che sostitusce la funzione carbossilica sono induttori di apoptosi in linee cellulari multidrug resistant (MDR), in linee cellulari resistenti all'apoptosi indotta da farmaci e in cellule che esprimono l'oncogene BCR-ABL. Si è appreso, quindi, che semplici modifiche alla struttura stilbenica degli arotinoidi può altamente influenzarne l'attività e che possono essere individuati composti a varia capacità verso il differenziamento e l'apoptosi (Simoni et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 2308; Org. Lett. 2000, 2, 3765). Durante questi studi è stato inoltre rimpiazzato l'alchene del TTNPB con un isossazolo o una isossazolina che possono irrigidire la molecola; vice versa, in altri derivati, è stato introdotto un ponte più flessibile amminometilenico o ossimetilenico. I nuovi composti hanno mostrato attività apoptotica in cellule MDR e in cellule che esprimono l'oncogene anti apoptotico BCR-ABL simile o maggiore a quella individuata per il derivato amminico del TTNPB. Il composto contenente il nucleo dell'isossazolina, acido 4-[3-(5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftalen-2-il)-4,5-diidroisossazol-5-il] benzoico (1), si è dimostrato privo dell'attività apoptotica ma con potente attività su recettori RXR. Viceversa, il derivato isossazolico 2, acido 4-[3-(5,6,7,8-tetraidro-5,5,8,8-tetrametilnaftalen-2-il)- isossazol-5-il] benzoico, mostra una potente azione pro-apoptotica. Più di recente è stata combinata la struttura del noto retinoide CD437 con la porzione isossazolica presente nei leads 1,2. I nuovi composti hanno mostrato attività antiapoptotica che sembra legata al rilascio del calcio dai mitocondri (Simoni et al. Blood, 2004, 103, 194). Anche strutture terfeniliche analoghe del CD437 hanno pure mostrato una potente attività antiapoptotica (Simoni et al. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3009). Le interessanti proprietà apoptottiche del trans-resveratrolo e di CA-4, due noti stilbeni naturali, hanno spinto Simoni et al. a studiare una serie di derivati di questi stilbeni naturali con lo scopo di identificare molecole dotate di attività apoptotica e selettività nei confronti di cellule neoplastiche. Alcuni dei derivati risultano attivi in cellule leucemiche dotate di multifarmaco resistenza (MDR) ed esprimenti alti livelli di NF-kB o esprimenti il gene antiapoptotico BCR-ABL (leucemia mieloide cronica) (Simoni et al. J. Med. Chem. 2003, 46, 3546; Blood, 2002, 44, 445; J. Med. Chem. 2004 inviato per la pubblicazione, patent RM2003A000355). E' stato così scoperto che i derivati 2-metossi-5-[3-metossi-5-(3,4,5-trimetossifenil)-4,5-diidro-4-isossazolil)]-fenolo (3) e il suo regioisomero 4 sono potenti induttori di apoptosi a concentrazioni inferiori a 0.1 _icromolare. La capacità di questi composti di bloccare il ciclo cellulare in fase G2 indica che il loro meccanismo d'azione non è legato alla polimerizzazione della tubulina e possono pertanto rappresentare nuovi leads ad attività apoptotica differenti dal progenitore CA-4. Questi dati indicano che piccole sostituzioni chimiche nella molecola stilbenica possono incrementare sensibilmente l'attività citotossica del composto. Inoltre, osservazioni preliminari su cellule normali di midollo emopoietico indicherebbero la bassissima mielotossicità dei nuovi derivati e l'elevata selettività su cellule tumorali. Attualmente sono in corso studi per comprendere il meccanismo d'azione dei nuovi derivati stilbenici. Ipotesi. Alterazioni strutturali dei leads 1, 2 e del CD437 portano a composti dotati di proprietà differenzianti e apoptotiche. La sostituzione degli anelli benzenici del CD437 con porzioni alcheniche è importante per ottenere potenti induttori di apoptosi. Alterazioni strutturali alla molecola della CA-4 fornirà nuovi agenti antitumorali selettivi per le diverse attività biologiche del composto naturale e mirati a target proteici specifici che intervengono nel processo apoptotico. Combretastatine irrigidite a livello della porzione alchenica con anelli eterociclici saranno dotate di potente attività apoptotica ma con un profilo farmacologico diverso dal composto naturale CA-4. Obiettivi. La facile accessibilità sintetica degli stilbeni naturali trans-resveratrolo, CA-4 e arotinoidi stilbenici sintetizzati in precedenza, associata alle loro interessanti proprità antitumorali, permettono di ipotizzare una facile progettazione di nuovi e potenti farmaci antitumorali strutturalmente correlati alla struttura stilbenica. Con la presente proposta di ricerca ci si attiverà per indagare a fondo le relazioni struttura-attività dello stilbene naturale CA-4 e degli arotinoidi di sintesi, come logico punto di partenza nella realizzazioni di nuovi agenti da utilizzare nella terapia del cancro. Per la valutazione della attività apoptotica dei nuovi composti sintetizzati ci si avvarrà della collaborazione dei Dott. Manlio Tolomeo e Luisa Dusonchet presso il Policlinico di Palermo Verranno studiate nuove alterazioni strutturali dei retinoidi 1, 2 e del CD437 al fine di ottenere nuovi agenti differenzianti e induttori di apoptosi. Verranno sostituiti gli anelli benzenici del CD437 al fine di ottenere agenti induttori di apoptosi. Verranno realizzati nuovi stilbeni selettivi per le diverse attività biologiche del composto naturale CA-4 e mirati a target proteici specifici che intervengono nel processo apoptotico. I nuovi composti dovranno essere dotati di potente attività apoptotica e dovranno pure costituire una classe nuova di agenti antitumorali. Saranno studiati i meccanismi d'azione delle nuove molecole sintetizzate. Obiettivi specifici: derivati citodifferenzianti e apoptotici strutturalmente correlati ai retinoidi. a) Nuovi derivati di 1, 2 e del CD437 saranno sintetizzati e testati al fine di valutare la loro attività apoptotica, differenziante e l'affinità recettoriale. Si potrà così verificare se le modifiche apportate, simili a quelle studiate su altri noti retinoidi, influenzeranno nello stesso modo i retinoidi isossazolici e il CD437. Le informazioni che si otterranno sulle relazioni struttura-attività potranno essere utili per progettare ulteriori retinoidi più attivi e selettivi. b) Nuovi analoghi del CD437 saranno sintetizzati sostituendo gli anelli benzenici presenti nel CD437 con doppi legami. Verranno cosi studiati gli effetti di una minore rigidità globale della molecola. L'obiettivo è anche quello di valutare quali sono i requisiti strutturali utili per guidare l'attività dei composti verso la componente apoptotica o antiapoptotica. c) Verranno studiati gli effetti della rigidità e della idrofilia dei sostituenti che funzionano da ponte nel leads 1 e 2. La loro componente eterociclica sarà elaborata in strutture acicliche, meno rigide, che comunque mantengono lo stesso scheletro carbonioso del TTNPB. Questi composti conterranno un ponte costituito da una funzione beta-amminochetonica oppure beta-idrossichetonica che comunque presentano lo stesso numero di eteroatomi dei lead di partenza ma con una aumentata capacità di formare legami idrogeno. Nel caso si riscontrino composti attivi, gli idrogeni presenti nelle funzioni amminiche dei linking saranno gradualmente sostituiti in modo da verificare più a fondo l'effetto del legame idrogeno sui recettori. d) Derivati dei leads 1 e 2 portanti un eteroatomo sulla porzione cicloesenica saranno sintetizzati in analogia ad altri noti retinoidi in quanto tale modifica si è visto essere determinante per contenerne la tossicità generale. Derivati di CA-4 ad attività apoptotica. a) Verranno sintetizzati nuovi derivati dei leads 3 e 4 che verranno testati al fine di valutare le loro proprietà citotossiche e apoptotiche. I nuovi derivati sarranno ottenuti attraverso la sostituzione del ponte isossazolinico con altri eterocicli pentatomici. Le informazioni ottenute dalla valutazione delle relazioni struttura-attività guideranno il progetto verso la realizzazione di nuove molecole. b)Verranno preparate nuove combretastatine dove l'anello aromatico trimetossi-benzenico verrà sostituito con altri eterocicli opportunamente sostituiti. Saranno considerate in una prima fase le sostituzioni con gli anelli del benzofurano, benzotiofene, furano, tiofene ed altri eterocicli. c) Sarà pure oggetto di studio la sostituzione di uno o più metossili con altre funzioni semplici polari o apolari (alcoli, ammine, eteri più complessi o funzioni alchiliche). d) Verranno sintetizzate nuove combretastatine dove l'anello B viene sostituito con un eterociclo benzofuranico e benzotiofenico portanti una funzione fenolica e metossilica. e) Verranno studiati gli effetti della rigidità e della idrofilia dei sostituenti che funzionano da ponte nei lead 1 e 2. La loro componente eterociclica sarà elaborata in strutture acicliche, meno rigide, che comunque mantengono lo stesso scheletro carbonioso. Questi composti conterranno un ponte costituito da una funzione amminoalcolica oppure beta-idrossichetonica che comunque presentano lo stesso numero di eteroatomi dei lead di partenza ma con una aumentata capacità di formare legami idrogeno. Nel caso si riscontrino composti attivi, gli idrogeni presenti nelle funzioni amminiche dei linking saranno gradualmente sostituiti in modo da verificare più a fondo l'effetto del legame sull'attività dei composti. f) I composti contenenti il linking amminoalcolico oppure beta-idrossichetonico, sintetizzati come riferito al punto e, saranno utilizzati come materiali di partenza per ottenere nuovi composti nei quali il linking è rappresentato da un eterociclo a 6 atomi. E' noto che strutture eterocicliche differenti possono influenzare in modo diverso l'attività biologica. Combretastatine portanti un ponte eterociclico a 6 atomi sono state fino ad ora poco studiate e quindi può risultare utile indagarne il loro possibile ruolo biologico. g) Il ponte etilenico della CA-4 naturale sarà sostituito con un gruppo isosterico di tipo chetonico. Verranno studiati analoghi come riferito nei punti 1-3 del primo anno. h) La Combrestatina e i suoi analoghi presentano una tipica struttura caratterizzata da due anelli aromatici polisostituiti uniti da una funzione di tipo olefinico (motivo stilbenico). La presenza di un gruppo ossidrilico di tipo fenolico su uno degli anelli di CA-4 rende queste molecole candidati ideli per un approccio sintetico su fase solida e ad una loro applicazione del tipo sintesi parallela allo scopo di produrre librerie di composti. In una prima fase di studio, si aggancierà un derivato dell'acido 3-idrossibenzoico (opportunamente sostituto come nell'anello fenolico della CA-4) ad una resina per poi trasformare la funzione acida nella relativa benzaldeide. Una reazione di olefinazione tra l'aldeide così supportata ed un'ilide fosforica aromatica polisostituita permetterebbe di accedere alla classe di analoghi sopra menzionati.
