RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Aspetti molecolari di patologie conformazionali proteiche. Ruolo dei fattori ambientali sulle variazioni strutturali di proteine per la progettazione e la sintesi di agenti ad attività antiaggregante, antiossidante, antiglicante e chelante nonchè per applicazioni in diagnostica.

Università di riferimento

Universita' degli Studi di CATANIA - SCIENZE CHIMICHE - CATANIA(CT)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enrico RIZZARELLI

Descrizione

Utilizzando le competenze dei componenti il gruppo di ricerca saranno condotte le seguenti attività: 1) Caratterizzazione della stabilità termodinamica delle proteine (Prione, amilina, a-beta amiloide e alfa-sinucleina) e correlazione con le loro caratteristiche conformazionali. 2) Sintesi e caratterizzazione di peptidi fibrillogenici, loro interazione con le membrane e con altre proteine native in assenza ed in presenza di ioni metallici Cu (II) e Zn (II). 3) Progettazione e sintesi di molecole con potenziale attività antifibrillogenica, antiossidante chelante e antiglicante. 4) Studio delle interazioni proteine-peptidi-piccole molecole e utilizzo dei risultati come constraints nelle analisi computazionali; Caratterizzazione della stabilità termodinamica delle proteine (Prione, anilina, a-beta amiloide e alfa-sinucleina) e correlazione con le loro caratteristiche conformazionali. La conversione delle proteine nei loro conformeri patologici, è accompagnato da notevoli cambiamenti delle caratteristiche chimico-fisiche. Tali modifiche coinvolgono essenzialmente la conformazione mentre la sequenza aminoacidica rimane invariata. Ogni modifica conformazionale (in questo caso una trasformazione da alfa elica a beta sheet) è accompagnata da trasferimenti di energia, la cui analisi dettagliata può fornire preziose informazioni sulla termodinamica dell' intero processo. Tecnica elettiva per questo genere di analisi è la DSC (Calorimetria Differenziale a Scansione). I calori specifici associati alle trasformazioni indotte dalla temperatura vengono monitorate al variare della temperatura stessa, fornendo una visione completa degli aspetti termodinamici che coinvolgono il processo. Alla caratterizzazione termodinamica dei processi di unfolding termico delle proteine potranno far seguito studi finalizzati a comprendere come piccole proteine, metalli e vari altri fattori ambientali, possono influire sui fattori termodinamici caratterizzanti l'unfolding termico dando così la possibilità di effettuare un vero e proprio screening di molecole quali potenziali stabilizzanti proteici e/o inibitori di aggregazione. Studi di Dicroismo circolare saranno condotti in parallelo per correlare le proprietà termodinamiche delle proteine con le loro caratteristiche conformazionali. Sintesi e caratterizzazione di peptidi fibrillogenici, loro interazione con le membrane e con altre proteine native in assenza ed in presenza di ioni metallici Cu (II) e Zn (II). I peptidi saranno sintetizzati in fase solida, utilizzando sia la chimica Boc che quella Fmoc. Saranno messi a punto protocolli di sintesi automatizzata su larga scala. Saranno utilizzati cicli di accoppiamento standard e modificati, solventi classici e loro miscele al fine di ottimizzare le rese della reazione di accoppiamento. I prodotti ottenuti saranno purificati utilizzando tecniche cromatografiche ed elettroforetiche e caratterizzati mediante spettrometria di massa. La loro conformazione sarà determinata in soluzione mediante dicroismo circolare, spettrofluorimetria e Risonanza Magnetica Nucleare ad alta risoluzione. In particolare, la variazione delle grandezze termodinamiche e i riarrangiamenti strutturali conseguenti alle transizioni conformazionali delle sequenze peptidiche sintetizzate saranno seguiti mediante tecniche di dicroismo circolare in diversi solventi e a diverso pH. Infine questi studi saranno importanti per trovare le migliori condizioni di pH e di solvente per i successivi esperimenti di risonanza magnetica nucleare. Opportune procedure di deconvoluzione degli spettri ottenuti forniranno, inoltre, le prime indicazioni di carattere strutturale. In particolare, i peptidi selezionati che si intendono caratterizzare sono: -PrP80-114. Questo peptide è rappresentativo di una regione con un contenuto inusualmente elevato di glicine. Esso contiene dei motivi ripetuti PHGGGWGQ insieme alla regione idrofilica del PrP 106-126, tutti deputatati a legare gli ioni Cu(II) e Zn (II); -PrP106-126. Si tratta di un peptide che rappresenta la sequenza piu conservata fra le differenti specie e che si trova fra la parte strutturata a quella non strutturata della proteina PrP. E' un peptide con attività neurotossica e gliotrofica in modelli in vitro. Verrà in particolare studiata la regione idrofila investigando il ruolo del gruppo amminico tramite la sintesi di frammenti liberi e bloccati all'N terminale. -PrP178-193 e 180-193. Si tratta delle sequenze corrispondenti al dominio dell'elica 2. E' stato dimostrato, recentemente, che tali frammenti peptidici esaltano l'attività citotossica del Cu(II). -Il peptide beta-amilode (1-42) è Il principale componente peptidico dei depositi delle placche amiloidi nell'Alzheimer. Suoi frammenti funzionalizzati con PEG saranno studiati per investigarne le caratteristiche conformazionali in soluzione. -Il frammento del peptide beta-amiloide 25 35. Un derivato sintetico del beta-amiloide, altamente tossico e fibrillogenico, che è considerato un sistema modello utile, unitamente ad alcuni suoi derivati (Gly 33 N-rnetilato e Leu 34 N-metilato), per testare inibitori dell'aggregazione e tossicità. -I frammenti 1-19, 1-30, 1-41, 1-52, 1-99 dell'alfa-sinucleina preparati dall'Unità Operativa di Padova. La nostra Unità studierà l'interazione fra questi frammenti e ioni metallici (Cu, Zn, Fe) e l'influenza di questi ultimi sulla fibrillazione. -Il peptide amilina 1-37. Il polipeptide coinvolto nei processi citotossici per le cellule pancreatiche. -Amu17-29 e Amu20-29. Frammenti tossici responsabili dell'aggregazione dell'amilina nell'uomo. -Amt17-29 e Amt20.29. Sequenze analoghe alle precedenti ma con le varianti esistenti nell'amilina del topo, dove la proteina non dà luogo ad aggregazione. Anche per questi frammenti saranno sintetizzati i relativi composti funzionalizzati con PEG. Verrà anche studiata, utilizzando diverse tecniche spettroscopiche, la capacità di questi peptidi di legare vari ioni metallici (per esempio, Cu, Zn a Mn), in modo da determinare la stechiometria e le costanti di binding. Saranno anche condotte indagini NMR dei complessi metallo-peptidi per studiare l'influenza dello ione sulla conformazione peptidica. Un ulteriore punto che si vuole perseguire è relativo alla capacità dei peptidi investigati di interagire con la membrana plasmatica formando canali ionici. In tal senso, verranno eseguite misure di calorimetria differenziale a scansione (DSC) sui relativi frammenti sintetizzati. Tali studi saranno condotti in presenza ed in assenza di ioni metallici. I dati sperimentali saranno combinati ed integrati con quelli computazionali e di modellistica molecolare al fine di razionalizzare sia gli aspetti strutturali che quelli operazionali dei targets e dei rispettivi leganti. Progettazione e sintesi di molecole con potenziale attività antifibrillogenica, antiossidante chelante e antiglicante. Il principale target nell'approccio terapeutico che vogliamo perseguire comporta l'utilizzo di piccole molecole che svolgono contemporaneamente almeno due funzioni. (antiaggregante e chelante oppure antiaggregante ed antiossidante etc…) finalizzati allo scopo di impedire i processi di aggregazione in prove vitro prodromiche di prove in vivo. La caratterizzazione del sito d'interazione di diverse molecole esogene con le proteine prioniche o con i peptidi "modello" permetterà di progettare e sintetizzare composti in grado di attraversare la barriera ematoencefalica. Gli approcci possibili nell'ideazione di potenziali farmaci, cosi come nello screening di quelli già esistenti sono vari. La nostra strategia si concentrerà sui seguenti punti: i) tentare di inibire la sintesi di PrPSC; ii) stabilizzare la conformazione di PrPC così da rendere la variazione conformazionale verso il PrPSC energeticamente più sfavorevole, iii) destabilizzare il PrPSC e cercare di renderlo sensibile all'azione della proteasi. Secondo evidenze recenti l'espressione della PrPC è incrementata in disordini che sono caratterizzati dalla presenza di danno ossidativo. Un peptide basato sulla regione ripetuta ad ottameri di PrPc è in grado di bloccare la tossicità causata da altri stress ossidativi o da rame esogeno. Questi risultati aprono nuove prospettive nel progettare e testare differenti tipi di farmaci. Infatti, l'ossidazione delle proteine catalizzata da metalli è implicata nella patogenesi della malattia di Alzheimer, della sclerosi laterale amiotrofica, del parkinson ecc: (Bush, 2000; Sifers, 1995). La carnosina (beta-AH) è una molecola scoperta cento anni fa ed alla quale, negli ultimi anni, sono stati attribuiti diversi ruoli biologici, fra i quali la regolazione delle concentrazioni intracellulari di ioni idrogeno, ioni metallici, ROS e glicidi. Diversi autori descrivono la carnosina come un farmaco protettivo nei confronti degli stress ossidativi e di malattie affini, incluse le alterazioni oculari. La carnosina esogena non si accumula nei tessuti e la sua distruzione, attraverso l'enzima carnosinasi, una dipeptidasi altamente specifica, presente nel plasma, avviene nel cervello, nel fegato e nei reni. Una carnosina acetilata, la N-acetil carnosina, è stata saggiata con particolare successo come pro-farmaco per il trattamento di alterazioni oculari causate da stress ossidativo. La N-acetil-carnosina viene degradata più lentamente della carnosina presente nei liquidi biologici. La carnosina resa stabile con la ciclodestrina (CD) mantiene le sue proprietà biologiche e farmacologiche. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che le beta-ciclodestrine bi-funzionalizzate con la carnosina sono un efficiente scavenger dei radicali OH. Poiché studi recenti hanno dimostrato che i beta-CD svolgono attività antiaggregante nei confronti dei peptidi beta-amiloidi si potrebbe ipotizzare per questi bioconiugati attività combinate metallo chelante, antiossidante ed antiaggregante. Nell'ambito di questo progetto l'attenzione sarà rivolta anche ad un altro composto con proprietà antiaggreganti, uno zucchero a basso peso molecolare, il trealosio capace di stabilizzare la conformazione delle proteine in piante soggette a stress ossidativo. Nuovi composti saranno sintetizzati con questo zucchero e la carnosina o la carcinina. Inoltre, saranno sintetizzati bio-coniugati contenenti farmaci antinfiammatori non steroidei. Diversi studi epidemiologici hanno dimostrato una riduzione del rischio per AD in pazienti usando antinfiammatori non-steroidei ed è stato riportato che l'ibuprofene sopprime le placche patologiche e l'infiammazione in modelli di topi con malattia di Alzheimer (Lim et al., 2000). L'azione neuroprotettiva dell'ibuprofene è stata più di recente correlata ad una riduzione della produzione cellulare di Abeta (1-42) (Weggen et al.,, 2001), tuttavia è stata anche riportata un'attività antifibrillogenetica per l'aspirina ed altri FANS. In particolare, si è osservato che questi farmaci, alle dosi impiegate nella pratica clinica sono in grado di modificare la conformazione beta-sheet di fibrille di Abeta preformate (Thomas et al., 2001). Pertanto valuteremo gli effetti dei FANS e dei bio-coniugati zucchero-FANS come composti antifibrillari La presenza di zuccheri dovrebbe: 1) aumentare la solubilità in acqua, 2) proteggere contro lo stress ossidativo dovuto ai radicali OH, e 3) diminuire i sintomi della gastrolesività. Una classe di molecole recentemente testate come agenti anti-prionici, è rappresentata dalle porfirine e dalle tetracicline. E' stato osservato, in vitro, che alcune di queste molecole sono capaci di inibire la formazione di PrPSC, presentando una scarsa, se non del tutto assente, attività citotossica. Inoltre, le stesse molecole somministrate per via intraperitoneale in cavie sono in grado di rallentare significativamente il decorso della malattia prolungando la vita degli animali infetti trattati. Anche questi leganti saranno utilizzati per ottenere i relativi bioconiugati e verificarne l'attività chelante antiaggregante ed antiossidante. Studio delle interazioni proteine-peptidi-piccole molecole e utilizzo dei risultati come constraints nelle analisi computazionali Si effettuerà la caratterizzazione strutturale e conformazionale dei complessi delle proteine e dei peptidi sintetizzati con molecole esogene facendo un uso combinato di diverse tecniche spettroscopiche (NMR, MS, CD, UV, Fluorescenza) e termodinamiche a supporto e/o implementazione-integrazione di tecniche computazionali. Sarà valutata l'influenza del pH, della forza ionica e di differenti solventi sulla strutturazione dei peptidi e sul legame di molecole esogene; inoltre sarà studiata l'azione di agenti denaturanti sulla stabilità conformazionale. Saranno condotte anche indagini calorimetriche sul PrPC sull'a-beta, sull'alfa sinucleina sui differenti frammenti peptidici e sui loro addotti con potenziali farmaci. Lo scopo è di acquisire dati energetici sul processo di autoaggregazione nonché sull'interazione con possibili farmaci. In particolare, saranno preliminarmente indagati i frammenti "tossici" di cui è nota la tendenza all'aggregazione nonché quelli in cui sia stata evidenziata la capacità di variazioni da alfa-eliche a foglietti beta. Le misure saranno estese anche ai sistemi in cui sia presente lo ione metallico (Cu2+, Mn2+, Zn2+), e per quei metalli con capacità redox, verranno considerate le variazione energetiche in presenza di H2O2. I risultati sull'energetica della variazione conformazionale e dei processi di aggregazione, saranno correlati con quelli ottenuti da misure NMR e dall'approccio conputazionale. Studi similari saranno anche condotti sull'aggregazione in presenza dei potenziali farmaci. Nella seconda fase sarà intrapreso uno studio sulla determinazione delle specie complesse formate da questi peptidi con vari ioni metallici (ad esempio, Cu2+, Mn2+ e Zn2+), utilizzando la spettrometria di massa e parallelamente sarà valutata l'influenza sulla conformazione. L'individuazione degli atomi donatori coinvolti nella formazione dei complessi e la geometria delle specie complesse saranno determinate con l'ausilio della spettroscopia e.s.r. Inoltre saranno eseguite misure di voltammetria ciclica che permetteranno di correlare i potenziali di ossido-riduzione e la struttura dei complessi. Mediante misure di FT-SPR saranno determinate le costanti di binding tra i peptidi e le nuove molecole da noi sintetizzate. Per individuare cause e meccanismi del disordine conformazionale dei sistemi proteici occorre far ricorso anche ad una ampia serie di metodologie computazionali capaci di fornire indicazioni dettagliate sulle strutture tridimensionali (3D) di biomolecole e sulla evoluzione temporale di tali strutture. Dal punto di vista metodologico, tutte le problematiche sopra citate possono essere ricondotte entro ben definite strategie computazionali: 1) simulazioni di Meccanica (MM) e Dinamica Molecolare (MD) di sistemi proteici in solvente e nel vuoto; 2) analisi della idropaticità e delle aree di interazione del target anche considerando frames a differenti tempi della MD; 3) MD delle variazioni di strutture proteiche, indotte dalla presenza di ioni metallici e/o di specie molecolari interagenti da analizzare come al punto 1.