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In anni molto recenti, l'alfa-sinucleina (aS) è emersa come una delle pochissime, fondamentali proteine coinvolte nella eziopatogenesi di tutte le malattie neurodegenerative legate ai corpi di Lewy (2). Tuttavia, manca ancora una comprensione definitiva della relazione causale tra la sua disfunzione e la degenerazione di cellule neuronali. Non è stato accertato a quale stadio aS diventi conformazionalmente alterata, e se danneggi le cellule neuronali già a livello di aggregati solubili e non-filamentosi. L'obiettivo di questa Unità è di definire i meccanismi che causano il cambiamento nella conformazione di aS e la sua aggregazione in protofibrille e fibrille. All'interno di questo obiettivo sono state progettate due linee di ricerca. Da un lato intendiamo stabilire le preferenze conformazionali di aS in soluzione in diverse condizioni. A questo scopo utilizzeremo una tecnica spettroscopica estremamente efficace, come l'NMR ad alta risoluzione, per rispondere a specifiche domande. In primo luogo, intendiamo determinare la struttura della porzione N-terminale della proteina in ambienti membrano-mimetici. Ciò potrebbe dare indicazioni sul ruolo fisiologico di questa molecola, a tutt'oggi sconosciuto. Secondariamente, intendiamo raccogliere informazioni sul/i sito/i di nucleazione per la formazione di fibrille dalla struttura di specifici frammenti della proteina. Infine, intendiamo caratterizzare e quantificare i diversi oligomeri solubili di aS mediante tecniche NMR avanzate. La seconda linea di ricerca consiste nella descrizione dell'interazione fra aS e specie chimiche che sembrano avere un ruolo nel definire la struttura di aS stessa. La prima classe di composti comprende i prodotti di ossidazione della dopamina (DAQ) generati (sia spontaneamente che per azione enzimatica) a partire dai neurotrasmettitori presenti nelle presinapsi neuronali. In questo ambito è essenziale determinare il/i sito/i di attacco, al fine di chiarire come questa interazione possa influenzare la struttura della proteina e la formazione di oligomeri di aS, protofibrille e fibrille. A questo scopo vorremmo controllare la natura chimica e la velocità di formazione dei DAQ usando la tirosinasi (Ty) umana, l'enzima che probabilmente agisce in vivo su questi substrati. La seconda classe di specie chimiche sono i metalli pesanti che, sulla base di studi in vitro, si pensa influenzino sia la conformazione che la reattività di aS. Svariati meccanismi per la fibrillazione di aS indotta da metalli possono essere immaginati. Il più semplice invoca un'interazione diretta fra la proteina ed il metallo, che porta a modifiche strutturali in aS le quali aumentano la sua propensione ad aggregare. Tuttavia la maggior parte delle ipotesi favoriscono un ruolo del danno ossidativo indotto dai metalli (29, 32, 33). La presenza di ioni metallici redox-attivi potrebbe facilitare il cross linking di aS ad opera dei DAQ, innescando quei processi che è stato suggerito promuovano la patogenesi della malattia di Parkinson (PD). Il ruolo potenziale di ioni metallici polivalenti come leganti a ponte è stato proposto per razionalizzare transizioni conformazionali indotte da metalli e l'aumento della velocità di fibrillazione di aS (29, 30). L'analisi strutturale qui proposta nasce dalla considerazione che poco si conosce riguardo le preferenze conformazionali e la topologia di aS legata alla membrana. La conformazione dei 100 residui N-terminali in SDS è stata descritta come un'elica estesa (21), come due alfa eliche distinte interrotte da una discontinuità a livello dei due residui 43-44 (23), ovvero come una conformazione non canonica, l'elica 11/3 (24). Nessuna correlazione nOe inter-residuo a lunga distanza tipica di strutture terziarie definite è stata osservata. Abbiamo già clonato la sequenza cofidicante per l'intera aS in E. coli, e una serie di mutanti per delezione che saranno sottoposti a studi strutturali. aS e le forme mutate sono state clonate in fusione con una His-tag in plasmidi pET al fine di ottenere una rapida ed efficace espressione delle proteine ricombinanti. L'espressione di proteine è stata ottimizzata in cellule batteriche cresciute in terreno minimo, per consentire la loro produzione con composti marcati (13C, 15N e possibilmente 2H) utili agli studi NMR. L'intera proteina ed il frammento 1-99 sono già disponibili marcati con 15N. Abbiamo anche sintetizzato i peptidi corrispondenti alle sequenze 1-19 e 1-30, ed espresso i frammenti 1-41 e 1-52. Questi peptidi comprendono l'elica N-terminale fortemente anfipatica e, rispettivamente, da una a quattro ripetizioni undecameriche che contengono la sequenza consenso KTKEGV. Intendiamo studiare la loro conformazione in presenza di ambienti membrano-mimetici e contiamo di ottenere informazioni su possibili interazioni terziarie che non erano identificabili nella proteina intera. Proponiamo di descrivere l'orientazione topologica della proteina rispetto alla superficie della membrana usando sonde paramagnetiche, sia inserite nella membrana a diverse profondità, che solubili in acqua (ioni). L'allargamento differenziale dei picchi NMR consentirà di determinare quali residui si trovano sulla superficie, quali dentro al nucleo idrofobico della micella e quali esposti al solvente. Questo studio sarà condotto su tutti i frammenti disponibili. L'ipotesi di un'interruzione nell'elica in posizione 43-44 (23) può essere verificata mediante misure di rilassamento sul materiale marcato con 15N. Pensiamo di condurre questi esperimenti sul frammento 1-99, sulla proteina intera, e su frammenti più corti se necessario. Questa analisi dovrebbe fornire informazioni inequivocabili sui moti locali della proteina ed identificare regioni più flessibili o più strutturate. In un primo momento useremo micelle, in quanto è stato dimostrato che in presenza di piccole vescicole unilamellari (SUV) i segnali sono troppo larghi a causa dei moti molecolari lenti, impedendo uno studio strutturale sulla proteina intera. Per meglio approssimare l'ambiente della membrana, in un secondo tempo pensiamo di utilizzare bicelle (34, 35). Questi sistemi mantengono le caratteristiche di doppio strato delle membrane lipidiche che sono scarsamente riprodotte dalle micelle, ed offrono il vantaggio di essere molto più piccole delle SUV. La tendenza a formare strutture beta è alta in molte parti della proteina, ed è stato evidenziato come l'aggregazione in fibrille avvenga attraverso le sequenze ripetitive della porzione N-terminale (5). Tuttavia, la sequenza 61-95, originariamente chiamata NAC e riscontrata nelle placche amiloidi della malattia di Alzheimer è il sito più probabile di induzione di struttura beta e della conseguente aggregazione. È stato dimostrato che questo frammento adotta una conformazione beta alle concentrazioni più elevate ottenibili in soluzione acquosa (0.011 mM) (28). Non sono stati eseguiti studi conformazionali in presenza di micelle o fosfolipidi, anche se è noto che la regione 56-102 è in grado di interagire con vescicole di fosfolipidi. Proponiamo di esprimere quest'ultima sequenza e di studiarla in presenza di un ambiente membrano-mimetico per determinare le condizioni sperimentali in cui possa avvenire una transizione verso la struttura beta. Infatti, è stato proposto che questa struttura derivi dalla conformazione disordinata presente in soluzione, ma non è stata considerata la possibilità di una transizione da alfa a beta, anche se la propensione per l'elica del peptide NAC è relativamente alta. Inoltre vorremmo capire se il peptide NAC può disporsi transmembrana, come suggerito da alcuni algoritmi di predizione strutturale. A questo scopo intendiamo usare sonde paramagnetiche in micella come più descritto sopra. Per studiare la disposizione di aS sulla membrana, intendiamo studiare mutati proteici sito-diretti legati a "spin-label" con spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (SDSL-EPR) (36). Intendiamo produrre quattro varianti specifiche di aS contenenti una sostituzione sito-specifica con cisteina che sarà etichettata con metantiosolfonato-spin-label. La definizione dell'intorno di ciascuna catena laterale legata a spin-label sarà usata per generare una mappa topologica della proteina (36). La natura chimica di un agente collisionale può fornire ulteriori informazioni sull'intorno dello spin-label. L'accessibilità di quest'ultimo all'agente collisionale polare ossalato di cromo è direttamente proporzionale alla sua esposizione all'ambiente acquoso. Per contro, la sua accessibilità a sonde paramagnetiche legate alla membrana è funzione di quanto all'interno della membrana lo spin-label è situato. Produrremo coppie di proteine mutate nelle quali la singola sostituzione con Cys sarà posizionata su residui vicini, ma situati su facce opposte dell'elica presunta. Una di queste coppie sarà collocata intorno al residuo 50, e l'altra intorno al residuo 80, per mappare la topologia di queste due regioni critiche, cioè quella delle sequenze ripetitive anfipatiche e quella del peptide NAC. Se questa strategia avrà successo (è possibile che ponti disolfuro intermolecolari interferiscano con la preparazione dei campioni), saranno considerati altri mutanti in altre regioni della proteina. Un altro aspetto importante del coinvolgimento di aS nella patogenesi è la possibilità che la formazione di fibrille sia preceduta da accumulo di oligomeri proteici solubili. È stato dimostrato che fattori come il pH e la temperatura producono intermedi parzialmente ordinati (4) e a concentrazione 0.1 mM è stata osservata la possibile presenza di <5% dimero (8). Proponiamo di studiare l'effetto del tempo e della concentrazione sulla oligomerizzazione di aS mediante tecniche NMR basate sulla diffusione. Questo approccio dovrebbe fornire chiare evidenze della formazione di dimeri o aggregati superiori. Un esperimento chiave che vogliamo eseguire in funzione del tempo su campioni di proteina non marcata in soluzione acquosa è il DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY). Lo spettro DOSY è uno spettro NMR pseudo-bidimensionale in cui la seconda dimensione è il coefficiente di diffusione del soluto (37, 38). Nel caso di uno scambio lento tra monomeri e oligomeri, è possibile risolvere i segnali derivanti dalle singole specie presenti. È stato riportato che aS dà aggregazione già a concentrazione 0.2 mM (5). L'uso di tecniche DOSY sarà determinante nel distinguere i pesi molecolari delle singole specie nella distribuzione di oligomeri. Sarà inoltre possibile seguire le cinetiche di aggregazione in condizioni diverse definendo così la stabilità dei vari intermedi solubili. Questo approccio fornirà uno strumento aggiuntivo per definire l'effetto di ioni metallici sull'aggregazione. Eseguiremo l'esperimento DOSY sui nostri costrutti proteici in presenza di opportuni metalli per descrivere il processo di oligomerizzazione e confrontarlo con quello in assenza di metalli. In questo contesto è altresì importante identificare i possibili siti di legame per i metalli e determinare l'influenza di questi sulla conformazione e sull'aggregazione. Intendiamo studiare l'interazione di vari metalli con i frammenti proteici di cui disponiamo, in stretta collaborazione con l'Unità di Catania. L'ultimo aspetto del programma è lo studio dell'interazione fra aS e i DAQ generati spontaneamente o enzimaticamente. La prima caratterizzazione dei DAQ sarà ottenuta per spettroscopia ottica per i passaggi iniziali della reazione e gli intermedi stabili saranno prima isolati con HPLC e poi caratterizzati strutturalmente, principalmente mediante NMR e spettrometria di massa. L'alta reattività di alcuni di questi chinoni, che in ambiente ossidante polimerizzano dando melanina, può essere evitata aggiungendo ascorbato al mezzo di reazione a diversi tempi, interrompendo così la reazione a livello dei primi intermedi (dimeri o trimeri) che sono le più probabili specie reattive nei confronti del bersaglio aS. Questo ci consentirà di identificare le specie chimiche realmente coinvolte nel processo di formazione degli addotti e anche di determinare i parametri cinetici delle reazioni che conducono ai vari addotti. Si tratta di un'informazione importante, poiché possono formarsi numerosi tipi di addotti, ma non tutti saranno rilevanti nella situazione in vivo. Quando la natura chimica e la reattività dei DAQ sarà ragionevolmente definita, questi verranno generati enzimaticamente in vitro (utilizzando una Ty umana geneticamente ingegnerizzata) in presenza delle molecole bersaglio (aS e i suoi frammenti). Le dimensioni dei diversi addotti aS-DAQ saranno caratterizzate mediante esperimenti DOSY. I vari addotti saranno anche separati per cromatografia e si cercherà di definire il sito esatto di reazione dei DAQ mediante analisi comparativa tra aS nativa e aS-DAQ. Le regioni della proteina che formano addotti saranno identificate mediante proteolisi controllata e successiva analisi ESI massa e sequenziazione ammino-terminale. Il profilo di frammentazione nello spettro ESI massa consentirà di identificare specifici amminoacidi nella catena polipeptidica covalentemente legati con i DAQ. Parallelamente a questa analisi strutturale sarà importante valutare l'effetto sulla reattività di aS rispetto ai DAQ in condizioni nelle quali vengono indotte regioni di struttura secondaria. In particolare vogliamo studiare il possibile ruolo protettivo delle membrane rispetto all'oligomerizzazione indotta dai DAQ. In seguito alla determinazione dei siti di legame dei DAQ, l'uso di dopamina e/o di proteina marcata con 13C e/o 15N sarà uno strumento per affrontare l'assegnazione NMR specifica di singoli residui coinvolti in interazioni terziarie con i DAQ. L'indagine strutturale degli addotti aS-DAQ potrebbe essere un punto di sviluppo futuro del progetto. L'ultimo aspetto della reattività degli addotti aS-DAQ che verrà preso in esame è l'effetto della modifica chimica sulla tendenza degli addotti aS-DAQ a formare fibrille, da soli o in combinazione con la proteina nativa. La sonda spettroscopica che verrà usata per lo studio del processo di aggregazione sarà l'aumento di intensità dell'emissione di fluorescenza descritto per la tioflavina T in presenza di fibrille). Questo esperimento ci porterà a correlare la natura delle modifiche di aS indotte dai DAQ con l'effetto inibitorio degli addotti aS-DAQ osservato rispetto alla formazione di fibrille. In secondo luogo, saremo in grado di correlare la frazione di aS-DAQ sul totale ai parametri cinetici della formazione di fibrille. Questo è particolarmente rilevante dal momento che entrambi gli effetti possono contribuire all'incremento di concentrazione delle protofibrille, intermedio che è stato proposto essere la forma tossica della proteina nell'eziopatogenesi di PD. Parte integrante di questo progetto è la produzione di Ty umana per il controllo della formazione di DAQ. Il dominio solubile di Ty (aa 22-474) è già stato clonato per essere espresso nel lievito metilotrofico Pichia pastoris. Attualmente stiamo effettuando uno screening su numerosi integranti di P. pastoris per determinare i cloni che presentano un maggiore livello di espressione di Ty. Intendiamo esprimere Ty come proteina secreta usando una sequenza segnale di S. cerevisiae per la secrezione già impiegata con successo: poiché P. pastoris secerne proteine native a livelli molto bassi, Ty risulterà costituire la maggioranza rispetto alle proteine totali presenti nel mezzo di coltura. Il vantaggio più importante nell'utilizzo di P. pastoris per l'espressione sarà la glicosilazione di Ty umana ricombinante, la quale porterà ad un corretto ripiegamento della proteina e ad un corretto caricamento del rame, con la produzione dell'enzima nella sua forma attiva. A questo scopo potrebbe anche essere considerata la clonazione e l'espressione in contemporanea della calnexina; in un esperimento simile su cellule COS, l'attività di Ty risulta aumentata.
