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Programma di ricerca
Aspetti molecolari di patologie conformazionali proteiche. Ruolo dei fattori ambientali sulle variazioni strutturali di proteine per la progettazione e la sintesi di agenti ad attività antiaggregante, antiossidante, antiglicante e chelante nonchè per applicazioni in diagnostica.
Università di riferimento
Università degli Studi di NAPOLI "Federico II" -
INGEGNERIA ELETTRONICA E DELLE TELECOMUNICAZIONI - NAPOLI(NA)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Guglielmo D'AMBROSIO
Descrizione
In questo progetto di ricerca ci proponiamo di verificare la possibilità di interferire con l'aggregazione e/o la formazione amiloide osservata in malattie da prione esponendo ad un campo magnetico a radiofrequenza (RF) un coniugato peptide/nanocristallo che ha come bersaglio la proteina prionica. Il progetto si svolgerà in tre fasi: 1. progettazione e sintesi di coniugati peptidi/nanocristalli in grado di legarsi alla proteina prione. 2. progettazione e realizzazione di un apparato in grado sia di controllare i parametri dell'esposizione a RF (frequenza, intensità, e, eventualmente, modulazione) sia di monitorare durante l'esposizione gli eventuali effetti indotti dal campo. 3. esposizione delle particelle contenenti il nanocristallo a un determinato campo magnetico e valutare gli effetti sulla conformazione della struttura dovuti allo stress indotto dal campo sul sistema nanocristallo/peptide. E' chiaro che una tale attività può essere sviluppata solo mediante un approccio interdisciplinare, poiché richiede competenze e strumentazione presenti in chimica e elettromagnetismo. La presenza nel progetto di due gruppi di ricerca provenienti da due istituzioni (Istituto di Biochimica e Bioimmagini del CNR, IBB; Dipartimento di Ingegneria Elettronica e delle Telecomunicazioni, DIET) che possiedono tali competenze rappresenta allo stesso tempo una condizione necessaria e la favorevole premessa a uno sviluppo del progetto coronato da successo. Fase 1. L'IBB, diretta dal Prof. Carlo Pedone, ha una esperienza pluridecennale nella sintesi organica e di peptici, testimoniata da un gran numero di pubblicazioni sull'argomento. Presso i laboratori dell'IBB esistono le competenze e la strumentazione necessaria per la sintesi di polipeptidi (chimica in fase solida) e per la funzionalizzazione con nanocristalli metallici sia di peptidi sia di proteine. I polipeptidi che dovranno essere funzionalizzati saranno prodotti mediante sintesi in fase solida (Fmoc chemistry) dopo un accurato studio che terrà conto di tutte le indicazioni reperibili in letteratura. La purificazione e caratterizzazione dei prodotti ottenuti saranno effettuate mediante tecniche HPLC standard, spettroscopia UV-VIS, e spettrometria di massa MALDI-TOF . La funzionalizzazione di tutti i polipeptidi con il nanocristallo potrà essere ottenuta per esempio mediante la formazione di un legame amidico tra un derivato succinimidico del nanocristallo e una amina primaria del polimero, ottenuta attraverso una reazione relativamente semplice ed altamente efficiente, seguendo protocolli riportati in letteratura. La purificazione dei prodotti ottenuti sarà ottenuta usando nuovamente tecniche di gel-filtration e HPLC. Fase 2. Contemporaneamente alla fase 1 presso il DIET verrà progettato realizzato e caratterizzato l'apparato per l'esposizione a RF e il monitoraggio in continua dei campioni. La necessità di esporre il bio-campione alla RF e simultaneamente rilevare gli effetti indotti richiede la progettazione e la realizzazione di un apparato sperimentale "ad hoc". Le proprietà ottiche (come assorbenza, scattering, fluorescenza) sono particolarmente indicate per seguire le variazioni strutturali indotte dal campo. Di conseguenza. il sistema di esposizione deve essere integrabile con il corrispondente sistema di misura ottico e con i portacampioni standard e le cuvette. Inoltre, per poter monitorare , o controllare, indesiderati effetti termici, è richiesto anche un sensore termico non perturbativo. Per quanto riguarda il campo elettromagnetico , si deve essere in grado di controllare la frequenza e, eventualmente, la modulazione, nonché la distribuzione del campo all'interno del campione. Considerando i risultati riportati in letteratura e le possibili applicazioni terapeutiche, una vasta gamma di frequenze verrà considerata: dalle decine di MHz a qualche GHz. A secondo della frequenza sarà necessario realizzare differenti apparati: mentre in bassa frequenza sembra obbligatorio l'utilizzo di bobine, alle alte frequenze tecniche a microonde potrebbero rivelarsi più efficaci, e saranno pertanto presi in considerazione porta-campioni a struttura chiusa, eventualmente risonanti. In alternativa, per poter coprire un ampio intervallo di frequenza con lo stesso sistema di controllo a RF, e per facilitare la sua integrazione con gli apparati ottici e termici necessari per il monitoraggio, si valuterà la possibilità di un impiego generalizzato di bobine sintonizzate. Codici di calcolo dedicati sarnno usati nel progetto dei portacampioni/applicatori del campo sia nel caso delle strutture chiuse, sia in quello delle bobine Requisito fondamentale, ed obiettivo della progettazione e messa a punto del sistema di esposizione è la sua integrazione con gli apparati per le analisi ottiche non perturbative. Si prospettano, da verificare comparativamente, due possibilità: quella di inserire l'aqpplicatore/portacampione in un dispositivo commerciale per l'ossevazione dei parametri ottici, oppure lasciare il portacampione meccanicamente separato dall'analizzatore ottico e ad esso connesso mediante fibre ottiche. E' opportuno notare che quest'ultima soluzione consente di rendere il sistema di esposizione portatile e integrabile con diversi analizzatori ottici. Dopo uno studio preliminare comparativo di fattibililità, il sistema di esposizione che risulterà più idoneo in termini di efficienza, compatibilità e costi, verrà realizzato e caratterizzato dal punto di vista delle sue caratteristiche ottiche. Per quanto riguarda il controllo termico, nell'apparato sarà necessario inserire anche un termometro a fibre ottiche. Una volta completato il sistema, le sue prestazioni verranno provate sia per quanto riguarda la parte a RF, mediante la strumentazione già esistente presso il laboratorio di microonde del DIET (generatori in onda continua o modulata, misuratori di potenza, analizzatori vettoriali di reti a microonde etc) sia per quanto riguarda la parte ottica, utilizzando soluzioni standard in modo da valutarne la sensibilità e riproducibilità. Fase 3. Gli esperimenti sui polipeptidi legati al nanocristallo verranno effettuati presso i laboratori dell' IBB considerata l'esperienza acquisita dal gruppo coinvolto sui peptidi prioni e i sistemi correlati. Le esposizioni verranno effettuate variando la frequenza (nell'intervallo di frequenze considerato), la modulazione e l'intensità del campo. Per valutare le variazioni strutturali indotte dal campo verranno effettuate misure di fluorescenza e di assorbimento nell'uv. L'effetto sull'aggregazione dei peptidi modello saranno valutati con lo stesso sistema.
