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La complessa natura delle molecole polifenoliche contenute nell'uva, ha impedito a tutt'oggi la loro completa caratterizzazione strutturale. Non sono, infatti, ancora disponibili metodologie accurate ed affidabili per la determinazione del contenuto totale di ciascuna classe di molecole (proantocianidine, flavoni, isoflavoni, stilbeni), per la valutazione della distribuzione dei loro pesi molecolari e tanto meno per l'isolamento dei composti puri. Il lavoro di ricerca si pone l'obiettivo di isolare i componenti di ciascuna classe di molecole, al fine di poterne determinare la struttura e le potenziali attività biologiche. La separazione preventiva della componente polifenolica dell’uva in base al diverso grado di polimerizzazione, permette di suddividere tali molecole in gruppi omogenei, semplificandone il successivo isolamento; tale separazione sarà condotta per estrazione in fase solida mediante due colonne Sep-Pak connesse in serie. L'eluizione con acqua (pH 7.0) permetterà di eliminare gli acidi fenolici (frazione I). La successiva eluizione con etile acetato (dopo aver anidrificato le colonne con una corrente di azoto) fornirà la frazione ricca di catechine e proantocianidine oligomere (frazione II), mentre l'eluizione con metanolo permetterà di eluire le proantocianidine polimere e le antocianine (frazione III). La separazione delle catechine dalle proantocianidine oligomere potrà essere realizzata caricando la frazione II sulle stesse colonne utilizzate in precedenza, preambientate con acqua a pH 7.0, dopo che questa sarà stata portata a secco e ridisciolta in acqua distillata. Dopo aver nuovamente anidrificato le colonne con azoto, l'eluizione con etere etilico fornirà le catechine (frazione IV), mentre le proantocianidine oligomere (frazione V) saranno eluite con metanolo. Il controllo del grado di polimerizzazione dei polifenoli ottenuti in ogni frazione, si potrà eseguire mediante cromatografia su strato sottile. Ciascuna frazione ottenuta dalle Sep-Pak, costituita da una miscela complessa di molecole polifenoliche e non, sarà sottoposta ad ulteriore purificazione mediante cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC). L'analisi per HPLC a fase inversa permette di risolvere bene miscele fino ai trimeri, mentre molecole più grandi appaiono come picchi slargati; inoltre sembra che non vi sia alcuna relazione tra grado di polimerizzazione ed ordine di eluizione. Studi di degradazione acida in presenza di fenil-metan-tiolo rivelano che le procianidine dell'uva contengono (+)-catechina, (-)-epicatechina, i loro gallati provenienti dai semi ed i loro gallo-derivati provenienti dalle bucce. Inoltre, ci sono prove dell'esistenza di copolimeri di essi; quindi con l'incremento del grado di polimerizzazione il numero di isomeri s'incrementa esponenzialmente rendendo i segnali HPLC degli oligomeri più grandi, molto slargati e quindi non purificabili con le attuali metodologie di separazione. L'analisi dei tannini del vino mediante HPLC/MS con sorgente elettrospray (ESI-MS), ha dimostrato che ogni picco proveniente dall'HPLC può contenere polimeri di catechina, gallocatechina o di entrambe, dimostrando ulteriormente la bassa efficienza degli attuali sistemi di purificazione. L'impiego della tecnica ESI-MS per l'identificazione delle proantocianidine è seriamente ostacolato dal limitato range di masse osservabili dagli analizzatori a quadrupolo presenti in tali strumenti (da 0 a 2000 uma); inoltre l'interpretazione degli spettri diventa proibitiva per le molecole adelevato peso molecolare a causa della presenza di picchi multicarica e di numerosi picchi di frammentazione. L'impiego della spettrometria di massa MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight) si è rivelato molto più promettente per l'analisi di miscele anche complesse di proantocianidine ad elevato peso molecolare. Questa tecnica è caratterizzata da una ionizzazione molto soft che impedisce la frammentazione e favorisce l'osservazione dei soli picchi molecolari, limitando al minimo la presenza di ioni multicarica. L'elevata sensibilità (dell'ordine dei picogrammi, per molecole di basso peso molecolare) ed il range di masse osservabili (dell'ordine di 100.000 uma) rendono questa tecnica ideale per l'analisi di miscele anche complesse di molecole ad elevato peso molecolare. L'impiego della spettrometria MALDI-TOF MS permetterà di conoscere la distribuzione dei pesi molecolari nelle singole frazioni provenienti dalle Sep-Pak, valutando l'efficienza della tecnica separativa in modo da poter effetturare opportune modifiche. Allo stesso tempo l'analisi degli spettri di massa consentirà di identificare i composti noti (la cui struttura sarà confermata mediante confronto con standard commercialmente disponibili ed analisi NMR previa purificazione) e quantificarne la presenza nei campioni analizzati, nonché di determinare il peso molecolare degli oligomeri e delle altre molecole che si cercherà di purificare mediante HPLC. Particolare attenzione sarà quindi rivolta alla scelta delle colonne cromatografiche da impiegare e delle più efficienti condizioni di eluizione. Tutti i composti isolati saranno caratterizzati mediante le più moderne tecniche di risonanza magnetica nucleare, e ne sarà saggiata l'attività biologica con particolare attenzione alle proprietà antiossidanti.
