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Questo programma si inserisce in un piano di rivalorizzazione e conservazione della flora locale, di salvaguardia ambientale e di sviluppo economico di aree marginali. A questo riguardo le piante officinali rappresentano una risorsa di particolare valore soprattutto in aree montane come la Valsesia. Gli obiettivi specifici attraverso i quali questa Unità Operativa intende fornire un contributo sono di seguito descritti. - Completare la raccolta di informazioni storiche relative all'impiego tradizionale ed alla presenza di piante officinali in Val Sesia. - Fornire le basi scientifiche per la rivalorizzazione e la coltura di specie botaniche con effetto sulla salute soprattutto al fine di creare le basi per nuove attività in loco, destinate ad un miglioramento dell'economia locale ed anche ai fini della salvaguardia delle risorse naturali e della eventuale conversione delle coltivazioni nel rispetto del paesaggio. - Valutare le caratteristiche chimiche e biologiche di diverse varietà di specie al fine di valutare il loro potenziale contributo al mantenimento della salute umana Piano della ricerca Primo semestre: Reperimento, con l'ausilio di un esperto botanico operante in loco, e identificazione tassonomica delle specie. Allestimento dell'erbario. Preparazione di estratti con solventi a polarita' crescente. Screening preliminari di attivita' biologica sugli estratti grezzi. Invio delle frazioni biologicamente attive alle unita' incaricate dell'analisi ed identificazione dei principi attivi. Successivi 12 mesi: saggi di attivita' biologica dei principi attivi (in forma purificata) preparati dalle unità di cui sopra. Ultimo semestre: completamento delle analisi, elaborazione dati e preparazione pubblicazioni scientifiche. Organizzazione di una giornata di aggiornamento e comunicazione dei risultati da svolgersi nelle zone in cui sono state raccolte le specie studiate. COMPITI SPECIFICI DELL'UNITA'OPERATIVA I compiti della nostra unità operativi possono essere divisi in: A) attività in campo comprendenti la raccolta e l'identificazione delle specie botaniche reputate di interesse biologico e socioeconomico in aree marginali, una rassegna fotografica relativa a specie oggetto di indagine e contesto ambientale, indagine relativa alle associazioni vegetali, prelievo di campioni di suolo, messa a dimora e conservazione ex situ. Verrà inoltre allestito un erbario delle piante aromatiche della Valsesia da depositare in loco presso il Museo di Storia Naturale. B) Attività di laboratorio comprendente la preparazione degli estratti grezzi ottenuti dalle specie raccolte da saggiare successivamente per valutare la loro attività biologica. Saggi bioguidati per individuare estratti e frazioni di interesse, in modo che alle altre unità venga inviato materiale "ad hoc". Saggi biologici delle attività antiossidanti ed estrogeniche di estratti preparati presso la nostra unità e di estratti inviati dall'Università di Perugia. Verranno infine svolti i saggi di attività biologica ed estrogenica di composti puri isolati dagli estratti grezzi risultati attivi durante negli esperimenti svolti nella prima fase del progetto. Test di attività antiossidante che la nostra Unità di ricerca intende eseguire sono i seguenti: i. capacità antiossidante ii. ossidazione LDL iii. danno al DNA iv. rimozione HOC v. rimozione superossidi vi. formazione trombossano B2 vii. formazione leucotriene B4 viii. attività dell'enzima mieloperossidasi La capacità antiossidante di estratti vegetali può essere saggiata attraverso lo studio della loro capacità di ridurre il rame bivalente a rame monovalente, che viene intrappolato da un cromoforo e puo' essere quantizzato allo spettrofotometro. Un altro metodo consiste nella valutazione dell'inibizione della formazione del catione ABTS* (ABTS radicale), anch'esso quantizzabile tramite spettrofotometria. L'ossidazione delle lipoproteine LDL (Visioli et al, 1995), parametro rilevante ai fini della valutazione del rischio cardiovascolare, può essere studiata mediate ossidazione di LDL umane procurata tramite l'aggiunta di sali di rame e successivo dosaggio delle aldeidi a corta catena (es. malondialdeide). La rimozione (scavenging) dell'anione superossido puo' essere valutata spettrofotometricamente tramite la sua generazione dal sistema xantina/xantina ossidasi. La formazione di trombossano B2 da parte di piastrine isolate da sangue umano viene valutata tramite dosaggio immunoenzimatico, cosi' come la formazione di leucotriene B4 da parte di neutrofili. L'attivita' dell'enzima mieloperossidasi, e la sua potenziale inibizione, puo' essere valutata in neutrofili umani tramite cinetiche rilevabili spettrofotometricamente. Il prodotto dell'enzima mieloperossidasi (HOCl) puo' essere rimosso da estratti vegetali. L'ossidazione, da parte di HOCl, di un composto cromoforo (DTNB) puo' essere quantizzata allo spettrofotometro. Il danno al DNA puo' essere valutato in vitro a seguito della sua ossidazione con un sistema generante radicali liberi come il radicale idrossile. Gli estratti grezzi e i composti puri con attività antiossidante verranno studiati per la loro attività estrogenica in vitro: i. Screening attività mediante test YES (yeast estrogen system) ii. Determinazione dell'attività specifica per il recettore alfa e beta La capacità di estratti e composti puri di interagire con recettori degli estrogeni viene valutata mediante tecniche basate su cellule ricombinanti sensibili agli estrogeni. La nostra UO possiede una significativa esperienza nell'utilizzo di questi tests (Agradi et al, 2001; Agradi et al., 2002). Una valutazione preliminare viene effettuata con un test con lieviti ingenierizzati con il recettore classico degli estrogeni ed il gene della beta-galattosidasi, come reporter. Una volta verificata l'attività estrogenica i composti verranno valutati parallelamente per la loro capacità di interagire con il recettore classico (alfa) e il recettore beta mediante l'applicazione di test basati su cellule (COS) trasfettate transientemente con l'uno o l'altro recettore e il gene dell'enzima luciferasi. C) Organizzazione di una giornata di aggiornamento e comunicazione dei risultati da svolgersi nelle zone in cui sono state raccolte le specie studiate. INTERAZIONI CON LE ALTRE UNITA' Invio ad altre unità per l'isolamento e l'identificazione dei principi attivi (Napoli e Molise) Invio delle specie raccolte per la propagazione in vitro e conservazione in apposita banca dati di germoplasma (Roma)
