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Il compito dell'Unità di Ricerca di Cagliari sarà quello di valutare l'attività biologica di una nuova serie di potenziali ligandi ad alta affinità e selettività per il PBR. In particolare, caratterizzeremo gli effetti di derivati imidazopiridinici, ottenuti apportando sostituituzioni alla struttura base imidazopiridinacetammidica introducendo nuove sostituzioni con gruppi polari o ionizzabili in posizione 2 del gruppo fenolico, e derivati ottenuti con la sostituzione del gruppo fenilico con un altro gruppo aromatico, come ad esempio il gruppo tiazolico. Tutti questi composti saranno sintetizzati e inizialmente caratterizzati per le loro proprietà chimico-fisiche e affinità recettoriale dall'Unità di Ricerca di Bari. In particolare, il nostro studio sull'attività biologica di queste molecole comprenderà le seguenti fasi: FASE 1. Analisi della capacità di legame (binding) delle molecole con il recettore periferico per le benzodiazepine. Si studierà la capacità delle molecole in esame di interagire e quindi competere per il recettore periferico per le benzodiazepine marcato con radioligandi selettivi come [3H]-PK 11195 e [3H]-CB34. La misurazione del binding specifico di questi radioligandi sarà effettuato in preparazioni di ovario e corteccia cerebrale di ratto. Mediante curve di inibizione con concentrazioni delle molecole comprese tra 10-9 e 10-4 M, si otterranno così informazioni sull'affinità di ciascun composto per questo recettore. (Tempo previsto: 4 mesi). FASE 2. Analisi della capacità di legame delle molecole con il recettore centrale per le benzodiazepine e effetti modulatori sulla funzione dei recettori GABA-A. Dal momento che alcuni composti imidazopiridinici, come lo zolpidem e l'alpidem, possiedono affinità sia per il PBR sia per il CBR, la ricerca di questa fase dovrà valutare la capacità delle molecole di interagire con il recettore centrale per le benzodiazepine. Il recettore centrale per le benzodiazepine verrà marcato con [3H]-flunitrazepam, e lo studio di binding verrà effettuato in preparazioni di corteccia cerebrale di ratto. Verranno utilizzate concentrazioni di ciascuna molecola comprese tra 10-9 e 10-4 M alfine di testare la loro capacità di inibire competitivamente il legame specifico del [3H]-flunitrazepam. Verrà inoltre applicata un'analisi elettrofisiologica (voltage-clamp) per valutare gli effetti modulatori delle molecole sulla funzione di recettori GABA-A. In particolare, verranno espressi in oociti di Xenopus laevis recettori GABA-A ricombinanti formati dalle subunità alfa1-beta2-gamma2, che costituiscono il sottotipo di recettore GABA-A più diffuso nel SNC dei mammiferi. Le correnti al Cl- indotte dal GABA saranno misurate in assenza o in presenza di concentrazioni crescenti (10-9 – 10-4 M) delle singole molecole. (Tempo previsto: 6 mesi). Obiettivi intermedi di queste 2 fasi della ricerca: Identificazione di nuove molecole imidazopiridiniche con elevata affinità e selettività per il recettore periferico per le benzodiazepine. FASE 3. Valutazione degli effetti delle molecole sulla sintesi di steroidi. Questo aspetto verrà valutato in vivo, nel ratto, in cui saranno misurati i livelli plasmatici e cerebrali di steroidi in seguito alla somministrazione i.p. delle diverse molecole. a) Trattamento in vivo dei ratti. Ratti maschi Sprague-Dawley verranno trattati con diverse dosi (determinate in esperimenti preliminari) delle diverse molecole in esame, e a tempi differenti (determinati in esperimenti preliminari) verranno sacrificati mediante decapitazione con la ghigliottina, per l'analisi degli steroidi nel plasma, o mediante irradiazione con microonde (per 4 secondi) focalizzate sul cranio, per la misurazione dei livelli cerebrali. Quest'ultima forma di sacrificio determina l'istantanea inattivazione degli enzimi nel tessuto cerebrale bloccando così il metabolismo degli steroidi dopo la morte dell'animale. b) Estrazione e misurazione dei livelli di steroidi Gli steroidi verranno estratti dai neuroni in coltura o dal cervello dei ratti trattati, con etile acetato e purificati su cartucce Seppak-silice. Gli steroidi verranno ulteriormente purificati e separati mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) su colonne lichrosorb-diol sviluppate con un gradiente discontinuo di 2-propanolo in esano. La misurazione dei singoli steroidi sarà effettuata mediante dosaggio radioimmunologico con anticorpi specifici sul contenuto delle corrispondenti frazioni ottenute dal frazionamento con HPLC. Gli steroidi verranno estratti dal plasma dei ratti trattati con etile acetato e misurati direttamente mediante dosaggio radioimmunologico come descritto sopra. La potenziale azione agonista dei diversi composti verrà valutata sulla base della loro capacità di stimolare la sintesi di steroidi, in comparazione con l'azione di ligandi selettivi per il recettore periferico per le benzodiazepine, come il PK 11195 o il CB34. L'azione antagonistica o inibitoria sulla sintesi di steroidi verrà valutata sia in condizioni basali che in seguito a stimolazione con PK 11195 o CB34. (Tempo previsto: 1 anno). FASE 4. Valutazione degli effetti neurosteroide-mediati sulla funzione dei recettori GABA-A in neuroni ippocampali in fettina di tessuto. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato (Sanna et al., J. Neuroscience, 2004 in press) che la perfusione delle fettine di ippocampo di ratto con l'agonista del PBR CB34 provoca un aumento significativo dell'ampiezza delle correnti postsinaptiche inibitorie in miniatura (mIPSC) mediate dal recettore GABA-A. Dal momento che la finasteride, che inibisce la formazione di allopregnanolone, previene l'azione del CB34, questo effetto sulla funzione dei recettori GABA-A sembra mediato dalla capacità del CB34 di stimolare la formazione locale di neurosteroidi. Questo modello in vitro è quindi utile per valutare ulteriormente gli effetti dei composti in esame e attivi sul PBR sulla produzione di neurosteoridi. Registrazione elettrofisiologica in neuroni di ippocampo in fettina di tessuto con la tecnica del patch clamp. Le fettine di ippocampo (300 um) verranno preparate da ratti maschi Sprague-Dawley di 14-21 giorni utilizzando un vibratomo. Mediante un microscopio ad infrarossi, le singole cellule piramidali dello strato CA1 dell'ippocampo verranno visualizzate e studiate con la tecnica del patch clamp in configurazione whole cell che permette la misurazione delle IPSC in miniatura o evocate sinapticamente. Le fettine verranno perfuse per 30 min con il composto in esame, durante i quali le mIPSC o le eIPSC saranno registrate a intervalli di 10 min, per periodi di 3 min. In esperimenti di controllo, alfine di valutare il ruolo della neurosteroidogenesi negli effetti osservati, la finasteride verrà perfusa per almeno 10 prima di essere perfusa insieme al composto in esame. Verranno analizzati diversi parametri tra i quali l'ampiezza, la frequenza e il tempo di decadimento delle correnti registrate. (Tempo previsto: 10 mesi). Obiettivi finali di queste 2 fasi della ricerca: Individuazione e caratterizzazione di molecole imidazopiridiniche ad alta affinità e selettività per il recettore periferico per le benzodiazepine dotate di azione di tipo agonistica (capaci di stimolare) o antagonistica (capaci di inibire) sulla steroidogenesi. FASE 5. Valutazione degli effetti delle molecole sulla sintesi di neurosteroidi in ratti sottoposti a stress da isolamento. L'isolamento sociale dei ratti, che ha luogo immediatamente dopo lo svezzamento e prosegue per 30 giorni è considerato un modello sperimentale di stress cronico. Il nostro laboratorio ha recentemente dimostrato che tale condizione si associa, da una parte, ad una riduzione dei livelli di neurosteroidi, e dall'altra, ad un aumentato effetto neurosteroidogenico del ligando selettivo per il PBR CB34 (Serra et al., Neurochem. Intern., 2004, in press). Su questo modello quindi testeremo gli effetti dei diversi derivati imidazopiridinici. Isolamento sociale dei ratti. Ratti maschi Sprague-Dawley di 30 giorni di vita verranno separati dalla madre e posti singolarmente in gabbiette dove verranno mantenuti per altri 30 giorni, al termine dei quali i saranno trattati con diverse dosi delle molecole in esame e quindi sacrificati come descritto in precedenza per la successiva misurazione dei livelli plasmatici e cerebrali di neurosteroidi. (Tempo previsto: 1 anno). Obiettivi finali di questa fase della ricerca: Valutare gli effetti delle nuove molecole ad attività selettiva sul PBR sulla formazione di neurosteroidi in condizioni di stress.
