RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

RUOLO DELLE INTERAZIONI PROTEINA-PROTEINA NEL SIGNALLING NUCLEARE LIPIDE-DIPENDENTE: APPROCCIO DI PROTEOMICA FUNZIONALE.

Università di riferimento

Università degli Studi di MODENA e REGGIO EMILIA - ANATOMIA E ISTOLOGIA - MODENA(MO)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Anto DE POL

Descrizione

L' OBIETTIVO GENERALE di questa Unita' di ricerca e' determinare il ruolo funzionale di Akt/PKB nel nucleo, cercando di identificare sia i suoi bersagli che i suoi regolatori nucleari. La recente identificazione della sequenza minima di consenso per Akt ha incredibilmente aumentato il numero dei suoi substrati putativi, se si considera che e' gia' stata riscontrata in piu' di 400 proteine. In particolare, numerose proteine substrato e non-substrato di Akt con funzione nota sono gia' state localizzate a livello citoplasmatico. La traslocazione di Akt in forma attiva al nucleo e' gia' stata ampiamente descritta (L.M. Neri et al. BBA, 2002, 1584: 73– 80). Inoltre, il nostro ed altri laboratori hanno adeguatamente dimostrato anche la localizzazione nucleare di molti altri componenti della via di segnale di PI 3-K/Akt, come la stessa PI 3-K (Bavelloni et al. 1999 J. Cell Science 112, 631-640), il PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3 e PDK1 (Curri R.A et al., 1999 Biochem J. 337:575-83). Nel loro insieme, queste osservazioni sollevano la possibilita' che una porzione di Akt intracellulare possa risiedere nel nucleo, dove sono localizzati sia i substrati che i regolatori, e non solo traslocare al nucleo dopo stimolo, nella sua forma attiva. Tuttavia l'identificazione dei substrati nucleari di Akt, nonche' delle molecole che ne regolano le funzioni, e' molto meno caratterizzata. Ci proponiamo percio'di realizzare lo studio dei partner nucleari di Akt attraverso l'uso di una specifica libreria di fosfopeptidica, proteomica funzionale e screening in banca dati. Percio', gli SCOPI SPECIFICI di questo progetto sono: i)stabilire se la lamina A/C e' un substrato nucleare di Akt. La Lamina A/C ha particolarmente attirato la nostra attenzione perche': i) analizzandone la sequenza attraverso il programma Web Scansite (http://www.scansite.mit.edu), abbiamo identificato residui di serina e treonina inseriti in un clusters di aminoacidi basici seguito da un residuo idrofobico, che rispondono ai requisiti piu' stringenti di fosforilabilita' da parte di Akt (R-x-R-x-x-S/T-F/L (Turk B.E.T. and Cantley L.C., Curr. Opinion Chem. Biol. 2003, 7:84-90); ii) la lamina A/C e' localizzata, oltre che nella lamina nucleare, nei nuclear speckles, dove sembra coordinare la distribuzione spaziale dei fattori di splicing del RNA (Muralikrishna Bh. 2001 J Cell Science 114, 4001-4011). Essa si localizza percio' negli stessi domini intranucleari in cui e' stata dimostrata la presenza di isoforme di PI 3K e del loro substrato PI4,5P2 (Osborne S.L. et al., 2001 J. Cell Science 114, 2501-2511); iii) la lamina A/C sembra svolgere un ruolo importante nel rimodellamento del nucleoscheletro che caratterizza il differenziamento muscolare, in accordo con l'alterata distribuzione della cromatina che si osserva in numerose patologie muscolari caratterizzate da mutazioni puntiformi della Lamina A/C (Osborne S.L. et al., 2001 J. Cell Science 114, 2501-2511; Morris, G. E., 2001, Trends. Mol. Med. 7, 572-577). Disegno sperimentale: L'analisi della sequenza indica che la lamina A/C possiede siti putativi di fosforilazione per Akt. Inoltre, questi siti creano ulteriori siti putativi di legame per le proteine 14-3-3. Dati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio indicano che infatti la lamina A (ma non la C) co-immunoprecipita con Akt. Intendiamo percio' verificare se Akt fosforila direttamente la Lamina A in vivo e in quale posizione. Il significato funzionale di questo evento dovra' essere attentamente valutato. Per questo scopo, in collaborazione con l'unita di ricerca 5, useremo colture primarie di cellule umane ottenute da pazienti affetti da laminopatie caratterizzate da mutazioni in prossimita' della sequenza consenso per Akt (queste colutre sono gia' in possesso delle unita' di ricerca). A conferma di queste osservazioni, si introdurranno mutazioni puntiformi, attraverso mutagenesi sito-diretta, nei domini di intersse del cDNA della Lamina. ii)identificare substrati nucleari di Akt. La conoscenza dei requisiti minimi di consenso per una determinata chinasi puo' essere utilizzata per produrre anticorpi diretti contro fosfopeptidi che riproducono tale sequenza nella sua forma fosforilata (Zhang H. et al., J.Biol.Chem. 2002, 277: 39379-39387).E' stato infatti dimostrato che gli anticorpi anti-fosfopeptidi sono molto utili nell'identificazione di substrati specific di chinasi (Manning A. et al., Mol. Cell. 2002, 10:151-162). Intendiamo percio' utilizzare le informazioni sulla sequenza consenso di Akt ottenute dall'uso di librerie peptidiche orientate e dall'analisi bioinformatica (Zhang H. et al., J.Biol.Chem. 2002, 277: 39379-39387), in combinazione con immunoprecipitazione e/o immunoblotting, seguiti da analisi bidimensionale e spettrometria di massa, per identificare substrati specifici di Akt nel nucleo. Disegno sperimentale: Abbiamo ricevuto da L.C. Cantley una libreria di fosfopeptidi, con residui fissi corrispondenti al motivo di consenso RXRXXT-*/S* per Akt, usata come antigene per produrre anticorpi che specificamente riconoscono molteplici differenti fosfoproteine, tutte contenenti il motivo stabilito. La separazione dei complessi proteici con tecniche di elettroforesi bidimensionale permetterà di separare le proteine in base al loro peso molecolare e al punto isoelettrico. Saranno allestiti anche saggi di immunoprecipitazione, pur tenendo ben presente che questi anticorpi, generati contro peptidi, potrebbero non riconoscere la fosfoproteina nella sua conformazione nativa. La digestione triptica degli spots proteici e la successiva analisi in spettrometria di massa consentirà, dopo analisi in banca dati, di identificare la proteina isolata dal complesso. Una conferma ulteriore si potrà avere processando i precipitati per eseguire western blot con l' utilizzo di anticorpi specifici. METODOLOGIA COLTURE CELLULARI. Le cellule C2C12 verranno coltivate in terreno D-MEM contenente il 15% di FCS. Per ottenerne il differenziamento in senso miogenico, le cellule, al 50-60% di confluenza, verranno passate in terreno di differenziamento (D-MEM con 1% FCS). Il differenziamento miogenico verrà valutato monitorando l'espressione dei markers del muscolare scheletrico Troponina T ( mediante western blot) e miogenina (mediante Northern Blottin, Cocco L. et al., 2001, Biochim.Biophys.Acta 1530,1-14). NUCLEI: verrà usata la tecnica dello shock ipotonico in presenza di 1% NP-40 e 10 mM beta-mercaptoetanolo, inibitori delle proteasi (PIC, SIGMA) e delle fosfatasi (NaF, beta-glicerofosfato, sodio ortovanadato) (S. Marmiroli et al., J Biol Chem 269, 13-16, 1994).Le preparazioni nucleari verranno analizzate per la contaminazione citoplasmatica usando come markers beta-tubulina (mediante western blot). La purezza delle singole preparazioni sara' inoltre controllata al microscopio elettronico. MATRICI NUCLEARI: i nuclei isolati verranno digeriti con DNasi I e RNasi A e poi estratti con 2M NaCl. Le matrici nucleari cosi' ottenute verranno sedimentate ed il sopranatante verrà usato come frazione contenente le proteine associate alla cromatina. Anche in questo caso verra' usato il cocktail di inibitori delle proteasi e delle fosfatasi (PIC, SIGMA). MATRICI in situ: cellule seminate su vetrini saranno incubate con un buffer 10 mM Tris-Cl, pH 7.4, 4 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40; successivamentesono digerite con DNasi (20U/ml), al fine di eliminarele strutture membranose, le proteine solubili e gli acidi nucleici, ma conservando il citoscheletro e il nucleoscheletro (Maraldi NM et al.,1993, Biol. Cell. 79, 243-250). Le matrici verrano utilizzate in reazioni di immunofluorescenza per la localizzazione intranucleare di PI 3K, Akt, PI4,5P2, PI3,4,5P3 e delle lamine A/C con anticorpi specifici. La co-localizzazione con le lamine A/C sara' calcolata con il software LaserPix (Bio-Rad). I campioni saranno analizzati con un microscopio confocale Radiance 2000 (Bio Rad) collegato ad un microscopia Nikon Eclipse TE300. PLASMIDI: saranno utilizzati i seguenti plasmidi, gia' disponibili presso l'Unita' di Ricerca: M2-Lamina A, FLAG-Lamina A, Hisx5-Lamina A, GST-Lamina A, M2-Lamina C, FLAG-Lamina C, Hisx5-Lamina C, GFP-Akt wt, GFP-MyrAkt (dominante positivo), GFP-AktT308A/S473A (dominante negativo), GFP-p85 wt; myc-110* (dominante positivo); myc-p110delta (dominante negativo); 6xHis-Akt in pFastBacHT. TRANSFEZIONI: le transfezioni con i plasmidi sopra riportati saranno effettuate con l'apparato di trasfezione ad alta efficienza Amaxa Nucleofector, con l'apparato BioRad Biolistic o con liposomi, seguendo le istruzioni del produttore. IMMUNOPRECIPITAZIONE ED IMMUNOBLOTTING: i nuclei sono lisati direttamente in tampone di immunoprecipitazione (20 mM HEPES pH 7,5, 1% NP-40, 50 mM NaF, 100 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 0,5 uM PMSF, 10 ug/ml leupeptina, 10 ug/ml aprotinina, 15 mu/ml inibitore I delle calpaine, 7 ug/ml inibitore II delle calpaine). Il lisato è chiarificato in microfuge a 10000xg per 15 minuti a 4°C. La concentrazione della proteina è determinata mediante il Bradford protein assay kit (Bio-Rad). Per l'immunoblotting, 30-80ug di estratto nucleare sono denaturati a 100°C per 5 minuti in Laemli sample buffer. Per gli immunoprecipitati, 0.5 mg di lisato è incubato per 3 ore a 4°C, con 3 ug di anticorpi anti-Tag, piu' 30ul di proteina A/G sepharose (10% w/v). Ilpellet è lavato per 2 volte in ciascuno dei seguenti buffer: PBS + 1% NP-40; 100 mM Tris-Cl pH 7,5, 500 mM LiCl e TNE. Tutti i tamponi contengono 1mM Na3VO4. Gli immunoprecipitati sono utilizzati per analisi SDS-PAGE o per saggiare l'attività enzimatica di Akt. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI. His6-Akt e' espresso come una proteina di fusione in cellule Sf9 di Spondoptera frugiperda infettate con Baculovirus (5x107 p.f.u./ml), che dirige l'espressione di 6xHis-Akt in pFastBacHT (Bac-to-Bac, Life Tech.). Dopo 3 giorni, le cellule vengono raccolte e lisate in un buffer di lisi contenente NP40 a 4°C. I lisati chiarificati vengono purificati attraverso una procedura "in batch" utilizzando resina di sefarosio coniugata a Ni2+ (Qiagen). La proteine, normalmente pura al 90%, viene conservata a -80°C in glicerolo 40%. PHOSPHORILAZIONE IN VITRO. 2ug di His6-Akt purificato sono combinati con un pellet di immunoprecipitato di anti-lamina A/C in un buffer contenente 20mM Tris-Cl 7.5, 25mM MgCl2, 80mM ATP con o senza 5uCi/saggio di [gamma32P] ATP (3000Ci/mmol) per 20 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni sono bloccate attraverso l'aggiunta di Laemmli sample buffer e riscladte a 95°C per 5 min. La fosforilazione del substrato sara' valuata mediante autoradiografia. ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE. Le cellule vengono lavate due volte con 10mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM Saccarosio. Il pellet viene risospeso con Tampone di solubilizzazione (7M Urea, 2M Thiourea, 4% CHAPS, 1% TRITON X-100, 1% DTT, 0,8% Anfoline). Dopo 5 min in ghiaccio si sonica con sonicatore a punta con due cicli di 20 sec. Si centrifuga a 14.000 rpm per 15 min. Si preleva il surnatante e si dosa la concentrazione proteica. 100 microg di proteina vengono utilizzati per la corsa elettroforetica di prima dimensione (Rabilloud T, Electrophoresis 1996,17,813-29). I campioni derivanti dal pull-down con proteine di fusione con GST vengono lavati in 10mM Tris-HCl pH 7.4 e quindi risospesi in 120 microl di tampone di solubilizzazione, scaldati a 50°C per 60 min e centrifugati a 14000 rpm per 5 min. Il surnatante viene utilizzato per la isoelettrofocalizzazione(Ghadimi M.P, et al, FEBS 2002,519,50-58). 100-150 ug di proteina in 125 microl di tampone di solubilizzazione vengono utilizzati per la isoelettrofocalizzazione che separa le proteine in base al loro punto isoelettrico. Dopo 16 ore di reidratazione della strip di poliacrilammide, si applica un voltaggio di 300V per 30 min, 8000 V per 4hr (Görg A.,Postel W., Gunther S., Electrophoresis 1988,9,531-546; Bjellqvist B., et al., Electrophoresis 1993,14,1375-1378). Al termine della prima dimensione le strips vengono equilibrate allo scopo di ridurre i ponti disolfuro utilizzando ditiotreitrolo (DTT) ed alchilare i gruppi sulfidrilici bloccandoli definitivamente con iodoacetamide. Le strips si trattano per 15 min con tampone di equilibrazione (Tris-HCl 50mM pH 8.6, Urea 6M, Glicerolo 30%, SDS 2%) con 2% DTT e per 8 min con tampone di equilibrazione con 4.5% iodoacetamide(Görg A, Postel W, Weser J,Günther S, Strahler JR, Hanash SM, Somerlot L, Electrophoresis 1987b,122-124) SDS-PAGE. La separazione delle proteine in base al loro peso si effettua in un gel di poliacrilammide al 12%. Si stratifica un piccolo volume di agarosio 0.1% in tampone di corsa sopra lo stacking gel e si adagia orizzontalmente la strip. Si applica un voltaggio di 120 V per circa 90 min.(Lämmli UK, Nature 1970, 680-685). Le proteine separate mediante gel di poliacrilammide vengono colorate con Blu di Coomassie disperso in una soluzione colloidale che permette una sensibilità di circa 8-10ng. Il gel viene lavato in acqua e fissato per 30 min in una soluzione al 12% di acido tricloroacetico. Viene colorato nuovamente in Blu di Coomassie colloidale per 3 hr e quindi decolorato in una soluzione 25% di metanolo in acqua.(Neuhoff V.,et al., Electrophoresis 1985,6,427-448). L'immagine del gel bidimensionale viene acquisita con densitometro GS-800 (BIORAD) ed elaborata con il software PDQuest (BIORAD) per l'identificazione e la comparazione degli spot proteici. DIGESTIONE TRIPTICA. Gli spot proteici sono tagliati dal gel e digeriti con tripsina per 16 hr a 37°C. I peptidi vengono recuperati con due estrazioni successive con acqua e una estrazione con soluzione 5% acido formico/ 50% acetonitrile in acqua. I campioni vengono concentrati e risospesi in 10 microl di 5% acido formico/ 50% acetonitrile(Shevchenko A,et al, Proc Natl Acad Sci 1996,USA,93, 1440-144). 1 microl della soluzione di peptidi viene deposta sul target per l'analisi al MALDI-TOF(Gobom J,et al, J Mass Spectrom 1999;34:105-16), con uno spettrometro di massa FINIGAN SSQ 710. IDENTIFICAZIONE DELLE PROTEINE MEDIANTE RICERCA IN BANCA DATI La lista delle masse dei peptici triptici determinate sperimentalmente mediante analisi MALDI viene confrontata con le masse teoriche dei frammenti ottenuti mediante digestione virtuale "in silico"; di tutte le proteine presenti nei database, si esegue cioè l'analisi "peptide mass fingerprinting" con il software Peptident al sito http://www.expasy.org/tools/peptident.html.