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Obiettivo di questa ricerca sarà quello di caratterizzare dal punto di vista neurochimico e molecolare gli effetti del trattamento prolungato con diversi farmaci antidepressivi (SSRI, NARI e ad azione mista) sulla sensibilità dei neuroni serotoninergici e noradrenergici. In particolare, verranno valutati gli effetti di questi antidepressivi sul rilascio di noradrenalina e serotonina e sull'espressione genica del BDNF e del suo fattore di trascrizione CREB nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale di ratto in condizioni basali e in risposta allo stress. I farmaci antidepressivi che utilizzeremo in questo studio sono selettivi per il sistema serotoninergico (SSRI) come la fluoxetina e la flovoxamina, oppure selettivi per il sistema noradrenergico (NARI) come la reboxetina, o ad azione mista (mirtazapina, imipramina e venlafaxina). Gli effetti sul rilascio di serotonina e noradrenalina verranno studiati con tecniche di microdialisi. L'espressione genica del CREB e del BDNF verrà valutata misurandone i livelli degli mRNA (utilizzando il saggio del'RNA protetto da RNasi o RPA) e delle rispettive proteine (utilizzando la tecnica del Western blot) nell'omogenato totale di queste aree cerebrali. Inoltre, il BDNF verrà specificamente localizzato sia nei neuroni serotoninergici che noradrenergici utilizzando tecniche di immunoistochimica. Questa tecnica ci permetterà così di localizzare, utilizzando la doppia marcatura, il BDNF in un tipo neuronale piuttosto che in un altro. Quindi saremo in grado verificare se gli SSRI che agiscono selettivamente sui neuroni serotoninergici sono in grado di aumentare i livelli di BDNF solo in questi neuroni, ovvero se i NARI aumentano i livelli di BDNF solo nei neuroni noradrenergici. Verranno utilizzati ratti maschi Sprague Dawley con un peso iniziale di circa 150 g. Gli animali saranno iniettati con uno dei farmaci antidepressivi sotto indicati secondo lo schema: Imipramina 10mg/kg (3ml/kg in H2O) 2 volte al giorno i.p. per 2 settimane Fluvoxamina, venlafaxina e reboxetina 10mg/kg (3ml/kg in H2O) 1 volta al giorno i.p. per 3 settimane Mirtazapina e fluoxetina 10mg/kg (3ml/kg in Tween-80/H2O) 1 volta al giorno i.p. per 2 o 3 settimane rispettivamente per mirtazapina e fluoxetina Il programma sarà articolato in quattro diverse fasi. FASE I EFFETTO DEL TRATTAMENTO PROLUNGATO CON DIVERSE CLASSI DI ANTIDEPRESSIVI SUL RILASCIO DI SEROTONINA E NORADRENALINA NELLA CORTECCIA PREFRONTALE E NELL'IPPOCAMPO DI RATTO INDOTTO DALLO STRESS ACUTO E DA SOSTANZE ANSIOGENICHE In questa prima fase della ricerca intendiamo valutare se il trattamento acuto e cronico con farmaci antidepressivi che potenziano selettivamente la trasmissione serotoninergica (fluoxetina e fluvoxamina) sono in grado di ridurre o antagonizzare l'aumento del rilascio corticale e ippocampale di noradrenalina indotto dallo stress acuto o dalla somministrazione acuta di farmaci ansiogeni. Valuteremo inoltre l'effetto di questi due farmaci antidepressivi, che potenziano selettivamente la trasmissione serotoninergica, anche sulla sensibilità dei neuroni serotoninergici corticali e ippocampali agli stimoli stressanti mediante la misurazione del rilascio di serotonina. Gli effetti della fluoxetina e della fluvoxamina sulla sensibilità dei neuroni serotoninergici verranno confrontati con quelli di farmaci antidepressivi con diversi meccanismi d'azione, come la reboxetina che inibisce selettivamente la ricattura della noradrenalina, oppure con antidepressivi che potenziano la trasmissione serotoninergica e noradrenergica o attraverso il blocco delle proteine di reuptake (imipramina, venlafaxina) o attraverso un antagonismo dei recettori adrenergici alfa2 (mirtazapina). Gli animali saranno trattati con i diversi farmaci antidepressivi secondo il protocollo sopra indicato. Ventiquattro ore dopo l'ultima somministrazione cronica del farmaco o del solvente corrispondente i ratti verranno anestetizzati con cloralio idrato (0.4 g/kg. i.p.) e verrà inserita una fibra da microdialisi a livello della corteccia prefrontale mediale o dell'ippocampo. Gli esperimenti verranno effettuati dopo ulteriori 24 ore per consentire agli animali un pieno recupero dall'intervento chirurgico. Il giorno dell'esperimento all'interno della fibra da dialisi verrà fatta passare una soluzione Ringer (125 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 23 mM NaHCO3, e 1.5 mM di fosfato di potassio, pH 7.3) con un flusso costante (2 µl/min) utilizzando una pompa da perfusione. I campioni (40 µl) verranno raccolti ad intervalli di 20 min e analizzati immediatamente utilizzando due differenti HPLC per la determinazione del contenuto di serotonina e di noradrenalina. Per la determinazione della noradrenalina verrà utilizzato un sistema di HPLC con rivelatore elettrochimico come precedentemente descritto [6]; per la determinazione della serotonina verrà invece utilizzato un sistema di HPLC con rivelatore coulometrico. Una volta raggiunta una concentrazione stabile di neurotrasmettitore (tre campioni nei quali la concentrazione non vari più del 20%) i ratti verranno sottoposti al foot-shock stress (0.2 mA per 500 ms/s) o riceveranno una somministrazione acuta del farmaco ansiogeno FG 7142 (20 mg/kg, i.p.), un agonista inverso del recettore alle benzodiazepine. Numerose evidenze sperimentali e cliniche hanno dimostrato che questo farmaco è in grado di riprodurre sia nei ratti che nell'uomo modificazioni comportamentali e neurochimiche molto simili a quelle indotte dallo stress [4] [5]. Il rilascio di neurotrasemttitori verrà monitorato per una o due ore rispettivamente dopo l'esposizione allo stress o la somministrazione di FG7142. FASE II EFFETTO DEL TRATTAMENTO PROLUNGATO CON DIVERSE CLASSI DI FARMACI ANTIDEPRESSIVI SULL'ESPRESSIONE GENICA DEL BDNF E DEL CREB NELL'IPPOCAMPO E NELLA CORTECCIA FRONTALE DI RATTO In questa fase della ricerca ci proponiamo di studiare gli effetti della somministrazione prolungata di antidepressivi sull'espressione genica del BDNF e del suo fattore di trascrizione CREB nell'omogenato di tessuto ippocampale e di corteccia frontale di ratto. Gli animali saranno trattati con i diversi farmaci antidepressivi secondo il protocollo sopra indicato o con il rispettivo solvente (animali di controllo) e poi sacrificati a diversi intervalli di tempo dopo l'ultima somministrazione di farmaco. Immediatamente dopo il sacrificio verranno prelevati l'ippocampo e la corteccia frontale che verranno congelati in ghiaccio secco e successivamente conservati a –70°C fino al giorno dell'utilizzo. I tessuti congelati verranno poi utilizzati per l'estrazione e la misurazione del mRNA codificante per il BDNF e per il CREB mediante il saggio dell'RNA protetto da RNasi, oppure per la misurazione dei peptidi corrispondenti mediante la tecnica del Western blot e l'utilizzo di anticorpi specifici per il CREB e per il BDNF. FASE III EFFETTO DELLO STRESS CRONICO SULL'ESPRESSIONE GENICA DEL BDNF NELL'IPPOCAMPO DI RATTO IN CONDIZIONI BASALI E IN SEGUITO A TRATTAMENTO PROLUNGATO CON DIVERSE CLASSI DI FARMACI ANTIDEPRESSIVI Allo scopo di valutare l'effetto degli antidepressivi in una condizione in cui i livelli di BDNF risultano ridotti utilizzeremo il restraint stress cronico con il quale è stata dimostrata una riduzione marcata di questa neurotrofina nell'ippocampo [24] [25]. Inoltre visto che il BDNF sembra essere coinvolto nella regolazione della neurogenesi ippocampale [26] e considerato che l'atrofia dei neuroni ippocampali può essere esacerbata da una riduzione della trasmissione GABAergica che inibisce l'attività sinaptica degli interneuroni sulle cellule piramidali dell'ippocampo [21], utilizzeremo anche un altro modello sperimentale per indurre lo stress, l'isolamento sociale [27]. L'utilizzo dell'isolamento sociale ci permetterà di valutare se anche in questa condizione di stress cronico si può avere una riduzione dei livelli di BDNF nell'ippocampo. Nel caso in cui l'isolamento sociale riduca i livelli di BDNF nell'ippocampo verrà studiato l'effetto degli antidepressivi per valutare la capacità di revertire questa diminuzione. RESTRAINT STRESS Il restraint stress consiste nell'immobilizzare l'animale facendolo entrare all'interno di una gabbia di plexiglass di dimensioni ridotte che non permettono il movimento dell'animale. L'animale verrà tenuto all'interno della gabbia per 30-120 minuti, e lo stress verrà ripetuto una volta al giorno per sette giorni consecutivi. Utilizzeremo due gruppi di animali, uno trattato con l'antidepressivo (verrà scelto quello che si è rivelato più efficace negli esperimenti della fase precedente) e uno di animali "naive" che verranno sottoposti allo stress secondo lo schema seguente: 1) Naive controllo: nessuno stress solo manipolazione. 2) Naive stress cronico: sessione di restraint ogni giorno per 7 giorni e sacrificio subito dopo la fine dell'ultima sessione. 3) Salina: sessione di restraint ogni giorno per 7 giorni durante gli ultimi 7 giorni di trattamento. La sessione di stress inizierà un'ora dopo la somministrazione del farmaco; il sacrificio subito dopo la fine dell'ultima sessione. 4) Antidepressivo cronico: sessione di restraint ogni giorno per 7 giorni durante gli ultimi 7 giorni di trattamento. La sessione di stress inizierà un'ora dopo la somministrazione del farmaco; il sacrificio subito dopo la fine dell'ultima sessione. Dagli animali dei diversi gruppi sperimentali dopo il sacrificio verrà prelevato l'ippocampo per la misurazione del messaggero che codifica per il BDNF mediante la tecnica del RPA e i livelli del peptide utilizzando la tecnica del western blot. ISOLAMENTO SOCIALE Alla fine dello svezzamento gli animali saranno stabulati singolarmente uno per gabbia, e verranno tenuti nello stato di isolamento per 4 settimane. Gli animali usati come gruppo di controllo verranno invece normalmente stabulati in gruppi di 5-8 animali per gabbia. Alla fine delle 4 settimane gli animali saranno sacrificati e verrà prelevato l'ippocampo e conservato a -70°C fino a quando i gli ippocampi non verranno processati. Allo scopo di stabilire se questo tipo di stress, prolungato nel tempo, è in grado di modificare i livelli di BDNF nell'ippocampo, verrà misurato sia il messaggero che il BDNF utilizzando la tecnica dell'RPA e dell'immunoblot rispettivamente. Nel caso in cui l'isolamento sociale induca modificazioni dei livelli di BDNF, verrà valutata la durata temporale di questa variazione e la capacità delle diverse classi di farmaci antidepressivi di ripristinare i normali livelli basali. FASE IV MAPPA DEI NEURONI SEROTONINERGICI E NORADRENERGICI IN CUI VIENE STIMOLATA LA SINTESI DI BDNF IN SEGUITO A TRATTAMENTO PROLUNGATO CON ANTIDEPRESSIVI In questa fase della ricerca ci proponiamo di studiare l'effetto delle diverse classi di antidepressivi sulla attivazione della sintesi di BDNF in specifiche popolazioni neuronali. Questo allo scopo di verificare se antidepressivi che hanno meccanismi d'azione diversi sono in grado di attivare la sintesi di BDNF in differenti popolazioni neuronali oppure se l'attivazione della sintesi è indifferente al tipo di antidepressivo che viene utilizzato. Le diverse popolazioni cellulari saranno identificate utilizzando tecniche di immunoistochimica che prevedono l'utilizzo di anticorpi specifici per la marcatura dei neuroni serotoninergici o noradrenergici. La doppia marcatura con anticorpi fluorescenti o con anticorpi coniugati a diversi cromogeni ci permetteranno di localizzare il BDNF nei neuroni serotoninergici e noradrenergici. Gli animali saranno trattati con gli antidepressivi utilizzando il protocollo precedentemente descritto. Alla fine del trattamento gli animali appartenenti ai diversi gruppi sperimentali saranno anestetizzati e i cervelli fissati mediante tecniche standard di perfusione con paraformaldeide. L'immunoistochimica verrà fatta su fettine flottanti sagittali e/o coronali dello spessore di 50 micron, ottenute da diversi livelli consecutivi dello stesso cervello. Le fettine verranno montate su vetrini e analizzate con un microscopio a fluorescenza e in campo chiaro (Olimpus, BX41). Le immagini digitalizzate saranno analizzate utilizzando un sistema di analisi di immagine.
