RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI COINVOLTI NELL'OMEOSTASI METABOLICA: ASPETTI FISIO-PATOLOGICI

Università di riferimento

Università degli Studi del SANNIO di BENEVENTO - SCIENZE BIOLOGICHE ED AMBIENTALI - BENEVENTO(BN)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Fernando GOGLIA

Descrizione

Scopo del progetto è chiarire i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nel controllo dell'omeostasi mitocondriale ad opera delle iodotironine. I problemi che saranno affrontati sono: A-Verificare se la T2 è in grado di influenzare l'adiposità attraverso la stimolazione dell'ossidazione dei grassi. B- Chiarire quali sono i meccanismi cellulari coinvolti negli effetti della T2 sull' adiposità del fegato. C-Studiare se le iodotironine influenzano l'espressione dell'acquaporina 8 in tessuti metabolicamente attivi. Il progetto sarà sviluppato come descritto di seguito: A- Per determinare se la T2 è coinvolta nella ossidazione dei grassi e nella regolazione dell'adiposità corporea, studieremo l'effetto del trattamento con T2 sul metabolismo epatico degli acidi grassi e sull'attività di enzimi coinvolti nell'uptake degli acidi grassi a livello mitocondriale. Lo studio sarà effettuato sul fegato di ratti sottoposti a dieta iperlipidica e sottoposti a dieta iperlipidica e contemporaneamente trattati con T2. L'assunzione di una dieta iperlipidica è una condizione nota per modificare i livelli di acidi grassi nel sangue e l'ossidazione epatica dei grassi.Saranno utilizzati ratti maschi Wistar (di 8 settimane)che saranno stabulati uno per gabbia alla temperatura controllata di 28°C (termoneutralità per il ratto) con un ciclo giornaliero luce-buio di 12 ore.I ratti saranno divisi in tre gruppi (12 animali per gruppo): 1) ratti di controllo (N) alimentati con dieta standard (percentuale energia metabolizzabile: 60,4 carboidrati, 29 proteine, 10,6 grassi J/J; 15,88 KJ/g), 2) ratti a dieta iperlipidica (D) (percentuale energia metabolizzabile: 21 carboidrati, 29 proteine, 50 grassi J/J; 19,85 KJ/g) e 3) ratti a dieta iperlipidica e contemporaneamente trattati con T2 (DT2) (iniezione i.p. giornaliera di 25microg/100 g di peso corporeo). I ratti N e D riceveranno una iniezione i.p. giornaliera di soluzione fisiologica. Al termine del trattamento, i ratti saranno anestetizzati mediante iniezione i.p. di cloralio idrato (40 mg/100 g di peso corporeo) e decapitati. Saranno prelevati i fegati e campioni di sangue per la preparazione del siero. Parte del tessuto epatico sarà immediatamente processato per la preparazione dei mitocondri, parte sarà immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a –80°C per la successiva estrazione dell'RNA e per le analisi istologiche. L'effetto della T2 sul contenuto di grassi sarà valutato sia sul fegato che nel siero. Il fegato di tre animali per ciascun gruppo sperimentale sarà fissato in calcio formolo e sezioni di 10micron saranno successivamente colorate con Sudan Black B per la messa in evidenza dei lipidi al microscopio. I livelli serici di colesterolo, trigliceridi e acidi grassi saranno determinati seguendo procedure standard.Per studiare l'effetto della T2 sulla funzionalità dell'asse tiroideo ed escludere un effetto tireotossico, saranno determinati mediante dosaggi radioimmunologici i livelli serici di FT3, FT4 e TSH. I livelli di TSH saranno misurati utilizzando materiali e protocolli sperimentali forniti dall'Amersham Bioscience (sistema BiotrakTM per TSH di ratto). I livelli di FT3 e FT4 saranno determinati utilizzando materiali e protocolli sperimentali forniti dalla Byk-Sangtec Diagnostica (Dietzenbach, Germania). Le analisi biochimiche saranno effettuate sui mitocondri di fegato di ratto. I fegati saranno omogeneizzati in 10 volumi di un mezzo di isolamento a pH 7.4 contenente : 220 mM mannitolo, 70 mM saccarosio, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 5mM EGTA. L'omogenato sarà centrifugato a 500 x g per 10 minuti a 4°C per rimuovere nuclei e membrane cellulari. Il supernatante risultante sarà ulteriormente centrifugato a 3000 x g per 10 minuti a 4°C per ottenere la frazione mitocondriale. Il pellet mitocondriale sarà lavato due volte e risospeso in un volume di mezzo di isolamento tale da ottenere una diluizione della frazione mitocondriale di 1: 0,5 rispetto al peso del tessuto di partenza. La concentrazione proteica mitocondriale sarà determinata secondo il metodo di Hartree (Hartree, Anal. Biochem., 1972, 48,422-427), usando albumina di siero bovino (BSA) come standard.La velocità della b-ossidazione mitocondriale sarà misurata polarograficamente mediante elettrodo di Clark in un volume finale di 0.5 ml a 30°C di una soluzione contenente: 80 mM KCl, 50 mM Hepes (pH 7), 1 mM EGTA, 5mM K2H PO4, BSA (1%), malato (2,5 mM) in presenza di ADP (120 μg/ml). La reazione sarà indotta dall'aggiunta di palmitoil-carnitina (40 µM) come riportato da ( Kerner, J. et al., 2001, Am. J. Physiol. 281: E1054-1062). Le cinetiche delle attività enzimatiche di MTE-1 e CPT (CPT1 + CPT2) saranno misurate spettrofotometricamente secondo la metodica di Alexson e Nedergaard ((Alexson SE and Nedergaard J, J. Biol. Chem. 1988, 263, 13564-13571).). L'attività totale CPT sarà determinata su mitocondri isolati trattati con Triton X-100 in presenza di palmitoilCoA saturante (50 microM) e carnitina (5 mM) essendo tale attività definita come la velocità di produzione di CoASH carnitina-dipendente dovuta agli enzimi CPT1 e CPT2. L'attività enzimatica di MTE1 sarà determinata secondo la stessa metodica utilizzata per CPT ma in assenza di carnitina, essendo tale attività definita come la velocità di produzione di CoASH carnitina-indipendente. B- Le vie molecolari coinvolte negli effetti cellulari della T2 sull'ossidazione degli acidi grassi nel fegato saranno studiate a livello di: i) espressione di mRNA, ii) espressione proteica e iii) attività enzimatica. Saranno utilizzati due modelli sperimentali di steatosi epatica. Uno sarà costituito da ratti alimentati con dieta iperlipidica come già descritto in A) mentre l'altro sarà costituito da ratti alimentati con dieta priva di colina per 10 giorni. Ratti di controllo saranno alimentati con dieta aggiunta di colina. Entrambe le diete saranno fornite dalla ICN Pharmaceuticals, S.r.L. Divisione Biomedicals, Milano, Italia. Il trattamento con T2 (25 microg T2/100 g p.c.) verrà effettuato sia a ratti alimentati con dieta iperlipidica sia a quelli alimentati con dieta priva ed aggiunta di colina così da poter studiare i suoi effetti sulla steatosi epatica. Una delle maggiori vie di attivazione dell'ossidazione degli acidi grassi coinvolge la stimolazione dell'attività della CPT ad opera del sistema AMPK (chinasi attivata dal cAMP) – ACC (acetil-CoA-carbossilasi) – malonilCoA. L'AMPK attivata fosforila ed inattiva l'ACC, abbassando in tal modo la concentrazione cellulare di malonilCoA, inibitore allosterico di CPT1, attivando quindi la CPT1. In diverse condizioni fisiologiche, è stato dimostrato che l'ACC è soggetta a regolazione sia trascrizionale che post-trascrizionale ad opera di AMPK. Un altro enzima coinvolto nella regolazione dei livelli cellulari di malonilCoA è la malonilCoA decarbossilasi (MCD) anch'essa bersaglio dell'AMPK. In base a ciò, studieremo, nei suddetti modelli animali, il possibile coinvolgimento di tali vie cellulari nell'effetto della T2 sul metabolismo lipidico epatico misurando l'attività enzimatica di ACC e MCD, e la fosforilazione di AMPK. In fine, per verificare se la T2 può indurre una utilizzazione meno efficiente dei substrati lipidici attraverso una stimolazione del disaccoppiamento mitocondriale, misureremo la cinetica di proton-leak mitocondriale. Per quantificare l'espressione in termini di mRNA mediante RT-PCR, l'RNA totale sarà preparato da campioni di tessuto congelato utilizzando Trizol secondo il protocollo sperimentale suggerito dalla casa produttrice (Invitrogen). L'RNA di ciascun campione sarà diluito alla concentrazione di 1μg/μl e 1μg di RNA totale sarà retro-trascritto usando 100 pmol di esameri random (Invitrogen Life Technoloies, roningen, The Netherlands), 2,0 unità di Trascrittasi inversa Superscript, 0,5 unità di inibitore delle RNAsi e 1 mM di deossinucleotidi trifosfato (dNTPs) in soluzione di retrotrascrizione (HT Biotechnoloy, Cambridge, UK). La reazione durerà 1 ora a 40 °C. Un quarto del volume di reazione di retrotrascrizione sarà usata direttamente per la reazione di PCR in un volume totale di 25 μl, contenente 0,25 unità di SuperTaq polimerasi, 0,25 mM di dNTPs, soluzione per SuperTaq (HT Biotechnoloy, Cambridge, UK), 5% (v/v) dimetilsolfossido (DMSO, Sigma-Aldrich Corp.) e 0,38 pmol degli specifici primers (Sigma Genosys, Cambridge, UK). Ciascun campione di cDNA sarà amplificato anche in presenza di oligonucleotidi primers specifici per il gene della β-actina, utilizzato come controllo interno. Per le analisi di Western Blot, i campioni di fegato saranno lisati e risospesi in tampone di caricamento come descritto da Laemmli (Laemmli UK, 1970, Nature, 22,680-685), e successivamente riscaldati per 3 minuti a 95°C. 30 μg di proteine di lisato saranno caricati in ciascun pozzetto per la separazione su gel di poliacrilammide 13% e 5%. Ciascun campione sarà analizzato in duplicato su due gel differenti. Le proteine di interesse saranno evidenziate mediante chemiluminescenza (NEN, Boston, MA) utilizzando anticorpi policlonali contro AMPK, AMPKP, ACC e MTE1 quali anticorpi primari e un anticorpo anti-coniglio coniugato alla perossidasi quale secondario in tutti i casi. Le attività enzimatiche note essere influenzate da AMPK saranno determinate come di seguito riportato. Per l'attività di ACC 0.1 g di fegato congelato saranno omogenizzati in 10 vol di 0.3 M mannitolo, 100 mM Tris/HCl (pH 7.4 at 4 °C), 2 mM EDTA, 50 mM NaF e 2 mM Na4P2O7 contenenti 1 mM benzamidina e 1 mM fenilmetano-sulfonil fluoruro. L'omogenato sarà centrifugato a 12000 x g per 3 min, e poli-etilene-glicole sarà aggiunto al supernatante ad una concentrazione finale del of 6% (p/v) come descritto da (Munday, M.R., et al., 1991, Biochem. J. 280, 733-737), lasciato in ghiaccio per 5 min, e poi centrifugato a 12000 x g per 3 min. Il pellet così ottenuto sarà dosato spettrofotometricamente per l'attività di ACC come riportato da (Tanabe, T. et al., 1981, Methods Enzymol. 71: 16-28). L‘attività di MCD sarà misurata dopo sua parziale purificazione dal fegato così come descritto da Dyck et al. (Dyck, JR et al., 2000, Biochem. J., 350,599-608). »200 mg di fegato congelato sarà omogenizzato in 30 volumi di una soluzione composta da 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 2 mM fenilmetilsulfonil fluoruro, 5 mM aprotonina, 5 mM leupeptina, 5 mM pepstatina, 40 mM NaF, 4 mM NaPPi, ed 1 mM Na3VO4. Gli omogenati saranno centrifugati a 500´g per 5 min a 4 °C. MCD sarà parzialmente purificata dal supernatante così ottenuto aggiungendo (NH4)2SO4 fino a raggiungere una saturazione del 40%-55%. Si ricentrifugherà a 14.000´g per 10 min a 4°C, ed il pellet che ne deriverà verrà ricostituito in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) e conservato a 4°C fino al momento del dosaggio. L'attività MCD sarà determinata spettrofotometricamente utilizzando una soluzione costituita da 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM ditiotreitolo, 0.6 mM NAD+, 1.0 mM malato, e malato deidrogenasi (74 unità). L'assorbanza sarà misurata e successivamente si aggiungerà citrato sintasi (1.7 unità). Una volta raggiunto l'equilibrio, 300 mM di malonil-CoA verrà aggiunto e si otterrà un'altra misura basale. Successivamente l'enzima parzialmente purificato verrà aggiunto e la velocità della reazione sarà data dalla variazione di assorbanza. Per ciascun campione una reazione identica ma in assenza di malonil-CoA esogeno sarà usata quale controllo. Per la determinazione della variazione cinetica della proton leak in funzione della variazione del DY, il potenziale di membrana e la respirazione saranno misurati simultaneamente nella stessa sospensione mitocondriale (1 mg/ml) alla temperatura di 37 °C, in un mezzo di incubazione contenente: 80 mM KCl, 50 mM Hepes (pH 7), 1 mM EGTA, 5 mM K2HPO4, 1 μg/mg di oligomicina utilizzata per inibire il flusso protonico attraverso l'ATP sintetasi. Il rotenone (4 μM) sarà aggiunto per inibire l'ossidazione NAD-dipendente di substrati endogeni. La nigericina (80 ng/ml) sarà aggiunta al mezzo di incubazione per annullare il gradiente di pH ai capi della membrana mitocondriale interna. La determinazione del consumo di ossigeno per la misurazione della proton leak verrà eseguita polarograficamente mediante l'elettrodo di Clark, mentre il DY sarà misurato mediante un elettrodo sensibile al trifenilmetilfosfonio (TPMP+ ). La respirazione sarà avviata in presenza di succinato saturante (5 mM). Il potenziale mitocondriale sarà variato mediante titolazione con malonato (0-5 mM). Per il calcolo del potenziale di membrana sarà applicato un fattore di correzione per il legame del TPMP pari a 0,4. In caso di effetto disaccoppiante della T2, cercheremo di identificare le proteine o i meccanismi coinvolti utilizzando specifici inibitori quali CAT e GDP. C- Gli effetti delle iodotironine sulla regolazione dell'omeostasi del volume mitocondriale attraverso l' acquaporina 8 saranno testati determinando i livelli di espressione dell' mRNA e di proteina rispettivamente nel fegato e nel Tessuto Adiposo Bruno (TAB) e nei mitocondri di tali tessuti, in ratti in diversi stati tiroidei ed in varie condizioni fisiologiche.Tali studi saranno condotti in collaborazione con l'unità Calamita. Saranno utilizzati ratti maschi Wistar (di 250-300 g) forniti dalla Charles Rivers (Lecco, Italy). Gli animali saranno stabulati uno per gabbia alla temperatura controllata di 28°C (termoneutralità per il ratto) con un ciclo giornaliero luce-buio di 12 ore e avranno accesso a cibo ed acqua ad libitum. L'ipotiroidismo sarà indotto mediante somministrazione intra-peritoneale di PTU (1mg/100 g p.c.) per 4 settimane insieme ad una iniezione settimanale di IOP (6mg/100 g p.c.). L'ipertiroidismo cronico sarà indotto da iniezioni giornaliere per 10 giorni di 15 microg T3 /100 g p.c. a ratti normali; ratti di controllo eutiroidei ed ipotiroidei saranno iniettati con soluzione salina. La dose di T3 e la durata del trattamento sono scelti in modo da indurre ipertiroidismo e non tireotossicosi (Moreno et al., 1997, J. Physiol., 505, 529-538). Oltre alla T3 anche la T2 sarà utilizzata per studiare un suo possibile coinvolgimento nell'espressione della AQP8. Altre condizioni fisiologiche che saranno utilizzate per studiare la regolazione dell'espressione dell' AQP8 saranno costituite dalla dieta iperlipidica e dalla esposizione al freddo. Alla fine dei trattamenti i ratti saranno anestetizzati mediante iniezione i.p. di cloralio idrato (40 mg/100 g p.c.) ed uccisi per decapitazione. Il fegato ed il TAB saranno isolati, pesati ed immediatamente processati per la preparazione dei mitocondri, mentre parte sarà immediatamente congelato in azoto liquido e conservato a –80°C per la successiva estrazione dell'RNA e per le analisi istologiche. I mitocondri saranno preparati come descritto in A) L'analisi di RT-PCR per l'acquaporina 8 sarà effettuata come riportato nella sezione precedente. Il prodotto della reazione di retrotrascrizione sarà utilizzato per amplificare mediante specifici primers senso e antisenso una regione della sequenza codificante dell'AQP8. Saranno effettuate amplificazioni parallele degli stessi campioni di RNA per amplificare parte della regione codificante per la β-actina utilizzata come controllo interno. L'analisi di Western blot per la proteina AQP8 sarà effettuata su lisati totali o sulle frazioni mitocondriali di fegato di ratto ottenute come descritto nelle sezioni precedenti. Per l'immunoblotting i campioni proteici (60 μg/well) saranno risolti su gel di poliacrilammide 13%. Dopo il trasferimento su membrana le bande proteiche di interesse saranno evidenziate mediante chemiluminescenza utilizzando come anticorpo primario un antisiero sviluppato in coniglio contro AQP8 di ratto (regione N-terminale) e come anticorpo secondario un antisiero di capra coniugato con perossidasi contro siero di coniglio.