RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI COINVOLTI NELL'OMEOSTASI METABOLICA: ASPETTI FISIO-PATOLOGICI

Università di riferimento

Seconda Università degli Studi di NAPOLI - SCIENZE DELLA VITA - CASERTA(CE)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonia LANNI

Descrizione

Lo scopo di questo progetto è studiare l'effetto delle iodotironina, T3 (triiodotironina) e T2 (3,5-diiodotironina), sul metabolismo del tessuto adiposo e del muscolo scheletrico. I principali obiettivi sono: A. Chiarire il meccanismo attraverso cui la T3 regola l'espressione di UCP3. In particolare i nostri studi saranno volti a chiarire se la T3 agisce mediante un meccanismo diretto, attraverso l'interazione con i recettori nucleari della T3 (TR), o un meccanismo indiretto che coinvolge gli acidi grassi provenienti dall'azione lipolitica esercitata dalla T3. A tale scopo utilizzeremo l'agente antilipolitico acido nicotinico (AN), che si è rivelato efficace nel diminuire rapidamente gli acidi grassi circolanti nel ratto. Il trattamento con questa sostanza, perciò, priva i tessuti della possibilità di utilizzare gli acidi grassi circolanti come substrato metabolico o come cofattori. Studieremo l'effetto della T3 sull'espressione dell'UCP3 in presenza e assenza di AN, in differenti tipi di muscolo. A tal fine, ratti maschi Wistar (250-300 g) (Charles River, Lecco, Italia) verranno stabulati individualmente in una stanza a temperatura controllata e con cicli di 12 ore luce/12 ore buio. Verranno utilizzati tre gruppi sperimentali: ratti di controllo eutiroidei, ratti ipotiroidei e ratti ipotiroidei trattati con una singola iniezione intraperitoneale (ip)di T3 (25 microg T3/100 g p.c.). L'ipotiroidismo sarà indotto attraverso somministrazione giornaliera di propiltiouracile (PTU) (1 mg/100 g p.c.), e settimanale di acido iopanoico (IOPA) (6 mg/100 g p.c.), per 4 settimane (tali ratti vengono designati P+I). Ad un sottogruppo di ratti P+I+T3 verranno somministrati 10 mg/100 g p.c. di AN (Fluka Biochimica, Buchs, Svizzera) ogni 2 ore per 8 ore prima della fine del trattamento (8 e 24 ore dopo l'iniezione di T3) secondo il metodo di Lowell (Lowell BB and Goodman MN 1999 Diabetes 36:14). L'analisi di RT-PCR dell'espressione dell'mRNA di muscolo verrà effettuata come segue: sarà effettuata l'estrazione dell'RNA totale dai muscoli gastrocnemio, soleo e cuore utilizzando il metodo Trizol (Invitrogen Life Technologies, Groningen, Olanda). Saranno analizzati, mediante una PCR semiquantitativa, campioni dell'RNA totale, preparato come descritto sopra, di tre animali per ogni gruppo sperimentale. Un microg di RNA totale sarà retrotrascritto utilizzando 100 pmol di random hexamers (Invitrogen) e componenti standard (HT Biotechnology, Cambridge, Gran Bretagna), per 1 ora a 40 °C. Un quarto della miscela della reazione di retrotrascrizione sarà utilizzata direttamente per una reazione standard di 30 cicli di PCR, adattando le temperature di annealing per ciascuna coppia di oligonucleotidi. I prodotti della reazione di PCR saranno quindi separati e visualizzati su un gel di agarosio 2% contenente bromuro di etidio. La quantificazione dei gel verrà effettuata mediante il programma Molecular Imager FX (Biorad, Hercules, CA, USA). B. Analizzare le modifiche nel profilo genico e nelle caratteristiche biochimico-strutturali cellulari di differenti tessuti muscolari in seguito a variazioni metaboliche indotte dalla T3. Valuteremo, oltre all'espressione dell'UCP3, l'espressione di due set di geni in diversi stati tiroidei: 1. Geni correlati all'UCP3 ed al metabolismo lipidico come la lipoproteina lipasi (LPL), 3-idrossi-3-metilglutaril CoA riduttasi (HMGR), Coenzima Q 7 (CoQ7), tioesterasi mitocondriale 1(MTE1), carnitina palmitoiltrasferasi (CPT). 2. Geni coinvolti nello shift strutturale del muscolo scheletrico che si verifica nel passaggio dal metabolismo lipidico al metabolismo glucidico e viceversa, ossia quelli che codificano per la catena pesante della miosina (MHC) IIb, IId (x), IIa e Ib. Poichè la variazione temporale dell'espressione di questi geni può dare forti indicazioni sulle correlazioni esistenti tra di essi, saranno effettuati esperimenti di time course in cui analizzeremo l'espressione dei geni sopra descritti. Inoltre effettueremo un time course dei livelli proteici mitocondriali di UCP3 e MTE1 in relazione ai livelli proteici di MHCIb e MHCIIb che determinano, rispettivamente, il fenotipo delle fibre lente e veloci. A tal fine saranno utilizzati ratti resi ipotiroidei (mediante PTU+IOPA) e trattati con T3 come descritto nella sezione A. I ratti verranno sacrificati a 6, 12, 24 e 48 ore dopo la somministrazione di T3. I livelli di mRNA dei geni in esame verranno analizzati attraverso il metodo di estrazione di RNA e il protocollo di RT-PCR come descritto in sezione A. Per valutare i livelli proteici di UCP3, MTE1, MHCIb e MHCIIb verrà effettuata un'analisi di Western blotting utilizzando le proteine isolate dai mitocondri e da lisato totale. Le proteine mitocondriali verranno isolate sminuzzando il muscolo scheletrico in un buffer tenuto in ghiaccio e composto da 220 mM di mannitolo, 70 mM di saccarosio, 20 mM di Tris HCl, 1 mM EDTA pH 7.4; il tutto verrà omogenizzato in un omogenizzatore Potter-Elvehjem. I nuclei e i detriti cellulari verranno rimossi mediante centrifugazione a 500 x g per 10 minuti e il sopranatante risultante verrà centrifugato a 8000 x g. Il pellet mitocondriale verrà lavato due volte e risospeso nel minimo volume di buffer di isolamento e mantenuto in ghiaccio. Le proteine da lisato totale verranno isolate mediante omogenizzazione con polytron di muscolo scheletrico in un buffer di lisi contenente 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM sodio pirofosfato, 1 mM u-glicerofosfato, con l'aggiunta dei seguenti inibitori di proteasi: 1 mM benzamidina, 4 microg/ml aprotinina, 1 microg/ml pepstatina, 2 microg/ml leupeptina, 5 microg/ml bestatina, 50 microg/ml N-tosyl-L-fenilalanina-clorometil chetone, e 0,1 mM fluoruro di fenilmetilsulfonile (tutto dalla Sigma Aldrich Corp., Milano, Italia). La concentrazione delle proteine verrà determinata con il metodo di Hartree (Hartree EF 1972 Anal Biochem 48:422) utilizzando come standard l'albumina da siero bovino (BSA). 30 microg di proteine mitocondriali (per la determinazione di UCP3 e MTE1) e 10 microg di proteine da lisato totale (per la determinazione di MHCIb e IIb) saranno separate su gel di poliacrilammide 13%-SDS e analizzate mediante tecniche standard di Western blotting utilizzando anticorpi specifici per UCP3 (Chemicon International, Temecula, CA, USA), MTE1 (gentilmente fornito dal Dott. S. Alexson, Karolinska Institute, Stoccolma, Svezia), MHCIb e IIb (Chemicon). Le proteine verranno visualizzate mediante il metodo della chemioluminescenza utilizzando un anticorpo secondario legato ad una perossidasi e un kit commerciale (NEN; Life Science Products, Boston, MA, USA). La quantificazione dei risultati verrà effettuata mediante il programma Molecular Imager FX (Biorad). C. Studiare gli effetti della T2 sulle variazioni biochimiche e morfologiche del tessuto adiposo bianco e bruno. Per analizzare eventuali cambiamenti morfologici e ultrastrutturali degli adipociti bianchi indotti dalla T2, noi esamineremo il tessuto adiposo bianco al microscopio ottico ed elettronico. A tal fine, i pezzi di tessuto verranno rapidamente immersi nel liquido di Bouin e in una soluzione di formalina 4 % tampone fosfato (pH 7.4). Sezioni in paraffina (5 micron di spessore) saranno colorate con il metodo tricromico di Mallory. Per la determinazione dei lipidi, sezioni congelate saranno fissate in formolo-calcio e colorate con Sudan nero B. Sezioni scelte a caso da ciascun gruppo sperimentale saranno fotografate al microscopio Nikon Eclipse E 600 munito di una fotocamera JVC-TK-C1381. Per la microscopia elettronica verrà effettuata una fissazione degli stessi tessuti nel fissativo di Karnosky in tampone cacodilato pH 7.4 e post-fissato in tetrossido di osmio 1%. I campioni saranno disidratati attraverso la serie ascendente di alcool e infine inclusi in resina epossidica Epon812. Sezioni semifini (1 micron) saranno colorate con blu di toluidina 1%. Sezioni ultrasottili saranno invece colorate prima con acetato di uranile al 4% e poi in citrato all'1% e osservate al microscopio elettronico a trasmissione Philips 301. I parametri morfologici verranno quantificati grazie all'impiego di un analizzatore di immagini. Per l'analisi morfometrica sezioni traverse verranno digitalizzate e osservate al microscopio ottico Nikon Eclipse E600 collegato ad una fotocamera JVC-TK-C1381 connesso ad un computer. Cinque sezioni random per ogni animale (colorate con la tricromia di Mallory) saranno analizzate usando il software Lucia ScMeas. I parametri ultrastrutturali verranno misurati su microfotografie elettroniche acquisite da uno scanner SCAPSCAN 1236 AGFA. In aggiunta saranno studiati gli effetti della T2 sull'espressione e l'attività della citocromo ossidasi, indice dell'attività respiratoria mitocondriale nel tessuto adiposo bianco e bruno (Lanni A et al 1994 Mol Cell Endocrinol 99:89), e sull'espressione dell'UCP1 nel tessuto adiposo bruno, in quanto un suo incremento è ritenuto indice di un'aumentata capacità termogenica di tale tessuto. L'espressione di UCP1 verrà analizzata mediante Western blotting di proteine mitocondriali, come descritto in sezione B, mentre i livelli di mRNA e della proteina citocromo C ossidasi IV subunità 5B saranno determinati utilizzando il metodo di RT-PCR e Western blotting descritti precedentemente. L'attività della citocromo ossidasi nell'omogenato e in mitocondri isolati sarà determinata polarograficamente a 25°C mediante un elettrodo di Clark seguendo una forma modificata della procedura di Aulie e Grav (Aulie A and Grav HJ 1979 Comp Biochem Physiol 62A:335), in 1,5 ml di mezzo di reazione contenente 30 microM citocromo C, 4 microM rotenone, 0.5 mM dinitrofenolo, 10 mM Na-malonato, 75 mM Hepes, pH 7.4. Per mettere in evidenza l'attività enzimatica verrà utilizzato il lubrol. L'attività sarà misurata come differenza tra la velocità del consumo di ossigeno osservato dopo l'aggiunta del substrato [4 mM Na-ascorbato con 0.3 mM N, N, N',N'- tertrametil-p-fenilene-diamina (TNPD)] e dell'omogenato (0.2 mg di proteine) o di mitocondri isolati (0.1 mg di proteine), e la velocità del consumo di ossigeno osservato dopo l'aggiunta del solo substrato, per valutare l'autossidazione dell'ascorbato.