Bibliografia
Agre A, Kozono D (2003). Aquaporin water channels: molecular mechanisms for human diseases. FEBS lett. 555:72-78.
Bajgar R, Seetharaman S, Kowaltowski AJ, Garlid KD, Paucek P (2001). Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial) ATP-sensitive potassium channel in brain. J Biol Chem 276:33369-33374.
Beavis A, Garlid KD (1990). Evidence for the allosteric regulation of the mitochondrial K+/H+ antiporter by matrix protons. J Biol Chem 265:2538-2545.
Belzacq AS, Vieira HL, Kroemer G, Brenner C. (2002) The adenine nucleotide translocator in apoptosis. Biochimie 84:167-176
Calamita G, Bischai WR, Preston GM, Guggino GM, Agre P (1995). Molecular cloning and characterization of Aquaporin-Z: a water channel from E. coli. J Biol Chem 270(49):29063-29066, .
Calamita G, Kempf B, Bonhivers M, Bishai WR, Bremer E, Agre P (1998). Osmotic regulation of the aqpZ water channel gene in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3627-3631.
Calamita G, Spalluto C, Mazzone A, Rocchi M, Svelto M (1999). Cloning, structural organization and chromosomal localization of the mouse Aquaporin-8 water channel gene. Cytogenet Cell Genetic 84:237-241.
Calamita G, Mazzone A, Bizzoca A, Cavalier A, Cassano G, Thomas D, Svelto M (2001a). Expression and immunolocalization of the aquaporin-8 water channel in rat gastrointestinal tract. Eur J Cell Biol 80(11):711-9.
Calamita G, Mazzone A, Bizzoca A, Svelto M (2001b). Possible involvement of aquaporin-7 and -8 in rat testis development and spermatogenesis. Biochem Biophys Res Commun 288(3):619-25.
Carbrey JM, Gorelick-Feldman DA, Kozono D, Praetorius J, Nielsen S, Agre P (2003). Aquaglyceroporin AQP9: Solute permeation and metabolic control of expression in liver. Proc Natl Acad Sci U S A 100:2945-2950.
Carreras FI, Gradilone SA, Mazzone A, Garcia F, Ochoa JE, Tietz P, LaRusso NF, Calamita G, Marinelli RA (2003). Rat hepatocyte aquaporin-8 water channels are down-regulated in extrahepatic cholestasis. Hepatology 37:1026-1033.
De Giorgi F, Lartigue L, Bauer MK, Shubert A, et al (2002) The permeability transition pore signals apoptosis by directing Bax translocation and multimerization. FASEB J. 16:607-609
DeLeve LD, Kaplowitz N. (1991). Glutathione metabolism and its role in hepatotoxicity. Pharmacol Ther 52:287-305
Desagher S, Martinou JC (2000). Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol 10:369-377.
Domenicali M, Caraceni P, Vendemiale G, Grattagliano I, Nardo B, Dall'Agata M, Santoni B, Trevisani F, Cavallari A, Altomare E, Bernardi M. (2001). Food deprivation exacerbates mitochondrial oxidative stress in rat liver exposed to ischemia-reperfusion injury. J Nutr. 131:105-10.
Ferri D, Mazzone A, Liquori GE, Cassano G, Svelto M,Calamita G (2003). Ontogeny, subcellular distribution and possible functional implications of an unusual aquaporin, AQP8, in mouse liver. Hepatology 38:947-957.
Fiskum G, Murphy AN, Beal MF (1999). Mitochondria in neurodegeneration: acute ischemia and chronic neurodegenerative diseases. J Cereb Blood Flow Metab 19:351-369.
Frigeri A, Nicchia GP, Verbavatz JM, Valenti G, Svelto M. (1998). J Clin Invest 102:695-703.
Fujii F, Nodasaka Y, Nishimura G, Tamura M (2004). Anoxia induces matrix shrinkage accompanied by an increase in light scattering in isolated brain mitochondria. Brain Research 999:29-39.
Garlid KD (1996). Cation transport in mitochondria-the potassium cycle. Biochim Biophys Acta 1275:123-126.
Garlid KD (1988). Mitochondrial volume control. in: Lemasters JJ, Hackenbrock CR, Thurman RG, Westerhoff HV (Eds). Integration of Mitochondrial Function. Plenum, New York, pp. 259-278.
Goglia F, Moreno M, Lanni A. (1999) Action of thyroid hormones at the cellular level: the mitochondrial target. FEBS Lett. 452(3):115-20.
Gradilone SA, Garcia F, Huebert RC, Tietz A, Larocca MC, Kierbel A, Carreras FI (2003). Glucagon induces the plasma membrane insertion of functional aquaporin-8 water channels in isolated rat hepatocytes. Hepatology 37:1435-41.
Grattagliano I, Lauterburg BH, Portincasa P, Caruso ML, Vendemiale G, Valentini A M, Palmieri VO, Palasciano G (2003). Mitochondrial glutathione content determines the rate of liver regeneration after partial hepatectomy in eu- and hypothyroid rats. J Hepatol 39:571-579.
Grattagliano I, Caraceni P, Portincasa P, Domenicali M, Palmieri VO, Trevisani F, Bernardi M, Palasciano G (2003). Adaptation of subcellular glutathione detoxification system to stress conditions in choline-deficient diet induced fatty liver. Cell Biol Toxicol 19:355-356.
Hackenbrock CR (1968). Ultrastructure bases for metabolicallty linked mechanical activity in mitochondria: II. Electron transport-linked ultrastructural transformations in mitochondria. J Cell Biol 37:345-369.
Haussinger D, Schliess F (1999). Osmotic induction of signaling cascades: role in regulation of cell function. Biochem Biophys Res Commun 255: 551-5.
Haussinger D, Schmitt M, Weiergraber O, Kubitz R (2000). Short-term regulation of canalicular transport. Semin Liver Dis 20:307-321.
Hill AE, Shachar-Hill B, Shachar-Hill Y (2004). What are aquaporins for? J Membrane Biol 197:1-32.
Kristian T, Gertsch J, Bates TE, Siesjö BK (2000). Characteristics of the calcium-triggered mitochondrial permeability transition in nonsynaptic brain mitochondria: effect of cycrosporin A and ubiquinone 0. J Neurochem 74:1999-2009.
Kuriyama H, Shimomura I, Kishida K, Kondo H, Furuyama N, Nishizawa H, Maeda N (2002). Coordinated regulation of fat-specific and liver-specific glycerol channels, aquaporin adipose and aquaporin-9. Diabetes 51:2915-2921.
Lanni A., Moreno M., Lombardi A. and Goglia F. (1996). Biochemical and functional differences in rat liver mitochondrial subpopulations obtained at different gravitational forces. Int. J. Biochem. Cell Biol. 28:337-343.
Lanni A, Moreno M, Lombardi A, Goglia F (1996). Calorigenic effect of diiodothyronines in the rat. J Physiol 494:831-837.
Lanni A, Moreno M, Lombardi A, Goglia F. (2003) Thyroid hormone and uncoupling proteins. FEBS Lett. 543(1-3):5-10.
Lanni A, Moreno M, Lombardi A, de Lange P, Goglia F. (2001) Control of energy metabolism by iodothyronines. J Endocrinol Invest. 24(11):897-913.
Moreno M, Puigserver P, Llull J, Gianotti M, Lanni A, Goglia F, Palou A (1994). Cold exposure induces different uncoupling-protein thermogenin masking/unmasking processes in brown adipose tissue depending on mitochondrial subtypes. Biochem J 300:463-468.
Mustafa MG, Utsumi K, Packer L (1996). Damped oscillatory control of mitochondrial respiration and volume. Biochem Biophys Res Commun 24:381-385.
Nicholls DG, Budd SL (1998). Mitochondria and neuronal glutamate excitotoxicity. Biochim Biophys Acta 1336:97-112.
Portincasa P, Moschetta A, Mazzone A, Palasciano G, Svelto M, Calamita G (2003). Water handling and aquaporins in bile formation: recent advances and research trends. J Hepatol 39:864-874.
Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, Agre P (1992). Science 256:385-387.
Reed JC, Green DR (2002). Remodeling for demolition : changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis. Nat Rev, Mol Cell Biol 9:1-9.
Saha N, Stoll B, Lang F, Haussinger D (1992). Eur J Biochem 209:437-444.
Spagnoli MF, Amicone L, Tripodi M, Weiss MC (1998). Identification of a bipotential precursor cell in hepatic cell lines derived from transgenic mice expressing cyto-Met in the liver. J Cell Biol 143:1101-1112.
Viggiano L, Rocchi M, Svelto M, Calamita G (1999). Assignment of the Aquaporin-8 (AQP8) water channel gene to human chromosome 16p12. Cytogenetics and Cell Genetics 84:208-210.
Wakabayashi T, Karbowski M (2001). Structural changes of mitochondria related to apoptosis. Biol Signals Recept 10:26-56.
Wieland P, Lauterburg BH (1995). Oxidation of mitochondrial proteins and DNA following administration of ethanol. Biochem Biophys Res Commun. 213(3):815-9.
Razionale Sebbene il trasporto netto di metaboliti osmoticamente attivi attraverso la membrana cellulare o le membrane che compartimentalizzano la cellula sia sempre associato ad un parallelo movimento osmotico di acqua, la via molecolare e il meccanismo con cui l'acqua attraversa tali membrane nell'ambito delle transizioni metaboliche fra stati fisiologici sono ancora enigmatiche. Elusive sono anche le conseguenze fisiopatologiche derivanti dalle alterazioni del trasporto transcompartimentale di "acqua metabolica". La nostra recente osservazione che le membrane di compartimenti subcellulari a funzione metabolica come i mitocondri ed il reticolo endoplasmatico liscio contengono il canale per l'acqua AQP8 e che l'espressione di questa acquaporina cambia nel corso delle transizioni metaboliche a cui va incontro la cellula (Ferri et al., 2003) apre un affascinante ed innovativo capitolo sul ruolo che tale AQP riveste nel mantenimento dell'omeostasi metabolica. AQP8 e omeostasi del volume mitocondriale La nostra osservazione circa la presenza di AQP8 nella membrana mitocondriale interna (Ferri et al., 2003) suggerisce che tale canale possa avere un ruolo chiave nel mantenimento del volume mitocondriale, condizione imprescindibile per il realizzarsi della fosforilazione ossidativa, processo che fornisce oltre il 90% della energia consumata dalla cellula (Garlid et al., 1988). La dimensione e la forma del mitocondrio dipendono dallo stato chimico-fisico della matrice mitocondriale il cui volume può variare rapidamente portando a rigonfiamento o raggrinzimento della matrice stessa a seconda della quantità di acqua che entra od esce dal mitocondrio (Mustafa et al., 1966). Il movimento di acqua fra mitocondrio e citoplasma è modulato osmoticamente dal movimento di metaboliti e di ioni quali Ca++, K+ e Mg++ (Garlid, 1996) nonché dalla concentrazione intracellulare di ossigeno (Fujii et al., 2003). Nostri studi preliminari evidenziano una diretta correlazione fra espressione di AQP8 nei mitocondri e fosforilazione ossidativa poichè negli epatociti di ratto AQP8 risulta espressa prevalentemente nelle subpopolazioni di mitocondri di maggiori dimensioni (Calamita et al, dati non pubblicati) noti per avere più elevate attività respiratorie (Lanni et al, 1996). Noi ipotizziamo che AQP8 abbia un ruolo importante nella modulazione delle dimensioni del mitocondrio come presupposto per la regolazione dell'attività respiratoria. Pertanto, un presupposto fondamentale del presente progetto sarà quello di caratterizzare la biofisica del trasporto osmotico d'acqua attraverso la membrana mitocondriale interna (la membrana mitocondriale esterna non rappresenterebbe una barriera alla diffusione dell'acqua per la presenza di grossi canali quali le porine) e di correlarne i risultati con le proprietà di permeabilità molecolare del canale formato da AQP8 attraverso le membrane biologiche. Studi di espressione eterologa di AQP8 in oociti di Xenopus laevis saranno effettuati per valutare possibili permeabilità di tale AQP nei confronti di piccoli soluti anaelettroliti o ioni che transitano attraverso le membrane mitocondriali. Lo studio, in collaborazione con l'Unità Goglia, della possibile associazione di AQP8 con alcuni componenti della membrana mitocondriale interna come il complesso del poro di transizione di permeabilità (PTPC) rappresenterà un altro attraente obiettivo della nostra ricerca. Regolazione di AQP8 nel fegato da parte di ormoni ad azione metabolica diversi dagli ormoni tiroidei. Noi abbiamo recentemente riportato l'esistenza di una stretta correlazione fra accumulo di glicogeno ed espressione di AQP8 nell'epatocita di topo e di ratto (Ferri et al., 2003) ad indicare un coinvolgimento funzionale per AQP8 nell'omeostasi metabolica dei carboidrati. Inoltre. nell'epatocita di ratto AQP8 è stata trovata essere modulata a livello post-traduzionale da parte del glucagone, un ormone noto per la sua forte azione sul metabolismo glucidico (Gradilone et al., 2003). Allo scopo di disporre di informazioni più dettagliate sulla regolazione trascrizionale, traduzionale e/o post-traduzionale di AQP8 nell'epatocita in corso di transizioni metaboliche in stato fisiologico noi studieremo l'effetto di ormoni metabolici sulla espressione e distribuzione subcellulare di AQP8 nell'epatocita. Ciò sarà fatto impiegando cellule MMH, una linea di epatociti murini in cultura nota per essere fortemente differenziata (Spagnoli et al., 1998) e che abbiamo trovato esprimere AQP8 in maniera endogena (Calamita et al., dati non pubblicati). Regolazione di AQP8 nei mitocondri di fegato di ratto da parte degli ormoni tiroidei ed espressione di AQP8 nel tessuto adiposo bruno (TAB) di ratto in corso di acclimatazione al freddo. Gli ormoni tiroidei hanno effetti notevoli sia sulla morfologia che sulla funzionalità dei mitocondri per cui è plausibile che essi possano regolare l'espressione di AQP8 nel TAB il cui compartimento mitocondriale subisce notevoli modificazioni in relazione alla temperatura ed al tempo di esposizione e, al tempo stesso, è controllato dagli ormoni tiroidei. In collaborazione con L'unità Goglia, si procederà allo studio della regolazione trascrizionale, traduzionale e/o post-traduzionale dell'AQP8 nei suddetti tessuti così come di seguito riportato. AQP8 nello stress ossidativo del fegato Il glutatione mitocondriale (GSH) modula la funzione mitocondriale stessa e la progressione del ciclo cellulare (Grattagliano et al, 2003). GSH garantisce la detossificazione da molecole tossiche derivanti dal metabolismo di sostanze endogene e di xenobiotici (DeLeve LD et al, 1991). Alterazioni metaboliche causano variazioni della compartimentazione intracellulare di GSH cui consegue l'aumento dello stress ossidativo; il fegato riveste un ruolo centrale a tal proposito. Lo studio del bilancio redox dell'epatocita in condizioni metaboliche fisiopatologiche permetterà una migliore conoscenza dei meccanismi di danno ossidativo epatico che, a sua volta, sarà correlato all'espressione epatica di AQP8. Organizzazione sperimentale e temporale del progetto di ricerca: Task 1 Caratterizzazione biofisica del trasporto osmotico di acqua attraverso la membrana mitocondriale interna. Saranno definite le proprietà biofisiche che caratterizzano il trasporto di acqua attraverso le barriere membranali del mitocondrio. Ciò fornirà informazioni fondamentali circa il movimento osmotico di acqua attraverso la membrana mitocondriale interna e la regolazione del volume mitocondriale. A tale scopo saranno preparati mitoplasti e vescicole di membrana mitocondriale interna di fegato di ratto di cui saranno determinati il coefficiente di permeabilità osmotica (Pf), l'energia di attivazione (Ea) e l'inibizione del trasporto d'acqua ad opera di agenti mercurialici. Tali studi saranno condotti mediante metodologia di stopped flow light scattering. Task 2 Permeabilità di AQP8 a piccoli elettroliti ed anaelettroliti. Saranno valutate possibili permeabilità di AQP8 a piccoli soluti neutri e a ioni inorganici (in particolare la permeabilità allo ione NH4+ di cui abbiamo già alcuni dati preliminari). Ciò permetterà di valutare la possibilità che AQP8 medi il movimento attraverso la membrana mitocondriale interna di soluti coinvolti nelle reazioni metaboliche che avvengono nei mitocondri. Gli studi saranno condotti in collaborazione col laboratorio del Prof. Peter Agre (Premio Nobel per la Chimica 2003) mediante ricostituzione funzionale di AQP8 in liposomi artificiali ed esprimendo eterologamente il cRNA di AQP8 in oociti di Xenopus laevis. Il plasmide per la produzione in vitro di AQP8 in lievito e quello per la sintesi in vitro del cRNA di AQP8 sono già disponibili presso il nostro laboratorio. I proteoliposomi incorporanti AQP8 saranno usati per valutare la permeabilità di piccoli soluti anaelettroliti (glicerolo, urea, formamide e acetammide) con un approccio di tipo radioisotopico mentre gli ovociti esprimenti AQP8 saranno usati per valutare possibili conduttanze anioniche o cationiche mediante metodologia di voltage clamp. Task 3 Regolazione trascrizionale e/o post-traduzionale di AQP8 nel fegato di ratto da parte di ormoni ad azione metabolica diversi dagli ormoni tiroidei. La possibile regolazione ormonale di AQP8 come sistema di trasporto di membrana coinvolto in processi metabolici sarà studiata valutando l'effetto di ormoni ad azione metabolica sulla espressione (mRNA e proteina) e distribuzione tissutale di AQP8 nelle cellule MMH (Spagnoli et al., 1998). Monostrati confluenti di cellule MMH saranno trattati in assenza (stato basale) o presenza di ormoni ad azione metabolica quali insulina, fattore di crescita insulino-simile, glucocorticoidi, glucagone e GH o dei relativi agonisti e le variazioni dei livelli trascrizionali e di distribuzione subcellulare di AQP8 saranno valutate rispettivamente mediante Northern blotting, immunoblotting ed immunofluorescenza confocale. Task 4 (in collaborazione con l'unità Goglia) Regolazione di AQP8 nei mitocondri di fegato di ratto da parte degli ormoni tiroidei. Sarà valutata l'espressione cellulare (mRNA e proteina) e, in particolare, mitocondriale (proteina) di AQP8 nel fegato di ratti ipotiroidei o con ipertiroidismo cronico comparandola a quella del fegato di ratti eutiroidei. Ciò permetterà di evidenziare possibili regolazioni trascrizionali e/o post-traduzionali di AQP8 da parte degli ormoni tiroidei. I ratti ipo-, iper- ed eutiroidei saranno generati secondo la procedura descritta da Goglia e coll. (Lanni et al, 1996). I livelli di mRNA di AQP8 saranno misurati mediante RT-PCR semiquantitativa e/o Real Time PCR mentre i livelli di incorporazione mitocondriale di AQP8 saranno determinati per immunoblotting e per analisi morfometrica ultrastrutturale (immunomicroscopia elettronica). L'incorporazione di AQP8 nei mitocondri di fegato rispettivamente ipo-, eu ed ipertiroideo sarà correlata ai dati che saranno ottenuti dall'Unità Goglia relativi alla capacità ossidativa e all'attività respiratoria dei mitocondri oggetto dello studio. Task 5 (in collaborazione con l'unità Goglia) Espressione di AQP8 nel tessuto adiposo bruno di ratto in corso di acclimatazione al freddo. Sarà valutata l'espressione trascrizionale e l'incorporazione di AQP8 nei mitocondri del tessuto adiposo bruno (TAB) di ratto durante l'acclimatazione al freddo comparandola a quella di TAB di ratti stabulati a temperatura ambiente. Ciò permetterà di valutare eventuali implicazioni funzionali di AQP8 nei processi di termogenesi che avvengono nei mitocondri del TAB. Particolare attenzione sarà rivolta alla incorporazione di AQP8 in subpopolazioni mitocondriali note per esprimere massima attività termogenetica durante l'acclimatazione al freddo (frazione mitocondriale 1000xg)(Moreno et al., Biochem. J. 1994). I livelli trascrizionali di AQP8 saranno misurati mediante Northern blotting mentre quelli proteici saranno valutati mediante immunoblotting ed immunomicroscopia elettronica. L'espressione di AQP8 sarà messa in relazione a parametri termogenici dei mitocondri di TAB. Task 6 (in collaborazione con l'unità Goglia) Studio dei sistemi redox glutatione-correlati epatici intra- ed extramitocondriali in varie situazioni metaboliche e apoptosi: correlazione con l'espressione di AQP8. Sarà valutato lo stato ossidativo del glutatione e delle proteine sulfidriliche e l'attività di sistemi enzimatici ad essi correlati (glutatione-reduttasi e perossidasi, tioredoxina) in mitocondri isolati e nello spazio extramitocondriale dell'epatocita di ratto in condizioni fisiopatologiche di alterazioni metaboliche. In particolare si propone l'utilizzo di modelli sperimentali quali: 1) ratti ipotiroidei o con ipertiroidismo cronico (procedura descritta da Goglia et al. (Lanni et al, 1996)), confrontati con ratti eutiroidei; nel modello ipotiroideo secondario a trattamento con propyltiouracile, componenti della nostra Unità hanno evidenziato un'alterazione basale dello stato redox del glutatione mitocondriale ed un'alterata risposta rigenerativa dopo epatectomia parziale (Grattagliano et al, 2003); 2) ratti con steatosi epatica indotta da dieta priva di colina nei quali lo stress ossidativo si potenzia in presenza di fattori aggiuntivi quali l'ischemia-riperfusione, come evidenziato da studi preliminari del nostro gruppo (Domenicali et al, 2001); 3) ratti sottoposti a digiuno prolungato (48 ore) nei quali è verosimile un'alterazione ossidativa spiccatamente mitocondriale; le manifestazioni sono addirittura piu' evidenti nel fegato già steatosico (Grattagliano et al, 2003); 4) ratti con legatura totale del dotto biliare comune (BDL) nei quali l'effetto citotossico della colestasi (in particolare del sale biliare desossicolato) è evidente anche a livello mitocondriale epatico (esp. in corso, Portincasa et al., 2004). In tali modelli sperimentali, informazioni su possibili alterazioni dell'omeostasi dei fluidi saranno ottenute valutando l'espressione di AQP8. Saranno utilizzate metodiche in spettrofotometria e immunoblotting su omogenati di fegato e mitocondri isolati per la determinazione rispettivamente dell'attività enzimatica e dei complessi glutatione-proteici (Wieland & Lauterburg, 1996). Il possibile coinvolgimento dell'isoforma mitocondriale di AQP8 negli eventi apoptotici che si attuano a livello mitocondriale sarà valutato con due approcci. Nel primo approccio, effettuato su fegato di ratto, i processi apoptotici indotti in condizioni di stress saranno abbinati all'espressione di AQP8 nei mitocondri di fegato. Nel secondo approccio, le possibili correlazioni strutturali e funzioanli fra il complesso del poro di transizione di permeabilità (PTP) e AQP8 saranno studiate mediante coimmunoprecipitazione in cui lisati mitocondriali di fegato di ratto saranno immunoprecipitati con anticorpi anti-AQP8 e le relative proteine immunoprecipitate saranno immunoblottate usando anticorpi anti-PTP (anti-VDAC, -esochinasi, -PBR o -creatina chinasi).
