RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI COINVOLTI NELL'OMEOSTASI METABOLICA: ASPETTI FISIO-PATOLOGICI

Università di riferimento

Università degli Studi di NAPOLI "Federico II" - FISIOLOGIA GENERALE ED AMBIENTALE - NAPOLI(NA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio BARLETTA

Descrizione

Il programma di ricerca prevede la valutazione dell'efficienza energetica dei mitocondri isolati dal fegato e dal muscolo scheletrico in ratti esposti al freddo ed in ratti con obesità indotta dalla dieta. Il disegno sperimentale concernente l'esposizione al freddo prevederà l'utilizzo di ratti maschi del ceppo Wistar di circa 60 giorni di età (200 g). L'esperimento sarà condotto in due tempi, uno per l'analisi dell'efficienza mitocondriale del fegato e l'altro per l'analisi dell'efficienza mitocondriale del muscolo scheletrico poiché le misure dell'attività mitocondriale devono essere eseguite entro poche ore dall'isolamento dei mitocondri per evitare perdite di attività. I ratti saranno suddivisi in due gruppi. Un gruppo di ratti sarà stabulato in una camera fredda mantenuta a 4°C per un periodo di 15 giorni, mentre il secondo gruppo sarà mantenuto alla temperatura di 24°C. Alla fine del periodo sperimentale i ratti saranno sacrificati tramite decapitazione. Il fegato o il muscolo degli arti posteriori sarà rapidamente rimosso ed utilizzato per la preparazione dei mitocondri. I mitocondri isolati saranno poi utilizzati per eseguire le determinazioni sia dell'attività respiratoria sia della conduttanza protonica basale ed indotta al fine di valutare l'efficienza. Negli esperimenti sull'obesità dieta-indotta, ratti maschi del ceppo Wistar di età adulta (circa 100 giorni di età) saranno indotti a sviluppare l'obesità tramite la somministrazione di una dieta iperlipidica e ipercalorica. Tale dieta è costituita da mangime standard di laboratorio supplementato con burro e con liofilizzati di carne. Nel corso del trattamento dietetico saranno controllati una serie di parametri metabolici, connessi con lo sviluppo dell'obesità, quali l'introito calorico, l'accrescimento corporeo ed il metabolismo basale. Per verificare l'insorgenza dell'obesità, alcuni ratti saranno sacrificati ad intervalli di tempo variabili dall'inizio del trattamento per la determinazione sulla carcassa della composizione corporea. Per la determinazione del contenuto lipidico della carcassa sarà utilizzato il metodo gravimetrico dopo estrazione con solventi organici secondo la procedura di Folch et al. (Folch J. Et al. 1957, J. Biol. Chem. 226: 497-510). Con una metodologia analoga sarà anche determinato il contenuto lipidico intramuscolare eseguendo l'analisi sul tessuto muscolare. Il contenuto proteico della carcassa sarà determinato con il metodo del biureto dopo solubilizzazione delle proteine in SDS-NaOH secondo Brooks et al. (Brookes, S.P.J. et al. 1995, Anal. Biochem. 226: 26-30). Il contenuto energetico della carcassa sarà invece determinato con l'uso della bomba calorimetrica. Saranno poi valutati sui ratti con obesità indotta dalla dieta i livelli serici di vari ormoni e metaboliti coinvolti nella regolazione del peso corporeo. In particolare i livelli serici della leptina, della T3 libera, dell'insulina e della adiponectina saranno determinati mediante dosaggi radioimmunologici o ELISA. I livelli serici di glucosio, acidi grassi e trigliceridi saranno misurati utilizzando kit enzimatici colorimetrici commercialmente disponibili. Una volta indotta un'obesità conclamata con depositi lipidici ectopici a livello muscolare, i ratti obesi saranno utilizzati per lo studio dell'efficienza energetica dei mitocondri isolati dal fegato e dal muscolo scheletrico. Alla fine del periodo sperimentale i ratti saranno sacrificati e saranno prelevati fegato o il muscolo scheletrico per preparare le popolazioni mitocondriali. Su questi preparati saranno effettuate le determinazioni sia dell'attività respiratoria sia della conduttanza protonica basale ed indotta al fine di valutare l'efficienza. In tutti gli esperimenti il trattamento, la stabulazione ed il sacrificio degli animali saranno eseguiti in conformità alle linee guida del Ministero della Sanità. PROCEDURE DI ISOLAMENTO DEI MITOCONDRI Per quanto riguarda la procedura di isolamento dei mitocondri di fegato il tessuto prelevato verrà sminuzzato e omogeneizzato in una soluzione contenente mannitolo 220 mM, saccarosio 70 mM, Hepes 20 mM, EDTA 2 mM e 0.1% (peso/volume) di albumina di siero bovino libera da acidi grassi, a pH 7.4, (diluizione 1:10) in un omogeneizzatore Potter Elvehjem settato a 500 rpm (4 colpi/min). L'omogenato sarà poi filtrato attraverso delle garze sterili e privato di cellule intatte e nuclei attraverso una centrifugazione a 1000 g per 10 minuti; i surnatanti ottenuti saranno di nuovo centrifugati a 3000 g per 10 minuti. Il pellet mitocondriale così ottenuto sarà lavato due volte ed infine risospeso in un tampone contenente LiCl 80 mM, HEPES 50 mM, Tris P 5 mM, EGTA 1 mM, 0.1% (peso/volume) di albumina di siero bovino libera da acidi grassi a pH 7.0. Caratterizzazioni microscopiche ed enzimatiche hanno mostrato che tale procedura di isolamento (centrifugazione a 3000 g per 10 minuti) fornisce una frazione cellulare che è costituita essenzialmente da mitocondri. La procedura di isolamento dei mitocondri del tessuto muscolare scheletrico sarà più complessa perché prevederà la separazione delle due popolazioni mitocondriali che caratterizzano tale tessuto, cioè la popolazione intermiofibrillare (IMF) e quella subsarcolemmatica (SS). A tale scopo il muscolo degli arti posteriori sarà rapidamente rimosso e liberato dall'eccesso di grassi e tessuto connettivo, e infine sminuzzato in una soluzione contenente 100 mM KCl, 50 mM TRIS, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.1 % (p/v) di albumina serica bovina libera da acidi grassi (BSA). I frammenti di tessuto così ottenuti saranno omogeneizzati con la soluzione suddetta (1:8 p/v) in un omogenizzatore Potter Elvehjem (Heidolph, Kelheim,Germany) regolato a 500 rpm (4 colpi al minuto). L'omogenato sarà poi centrifugato a 500 g per 10 minuti e il precipitato sarà poi usato per la preparazione dei mitocondri IMF. Il surnatante, invece, sarà centrifugato a 3000 g per 10 minuti e il pellet ottenuto, contenente mitocondri SS, sarà lavato due volte e risospeso in un mezzo contenente 250 mM saccarosio, 50 mM TRIS, pH 7.5, 0.1 % di BSA. Per ottenere la frazione IMF, invece, il pellet derivato dalla centrifugazione a 500 g sarà risospeso in una piccola quantità di soluzione di omogeneizzazione e trattato con proteasi nagarse (1 mg/g di tessuto) per 5 minuti. L'utilizzo di tale proteasi permetterà la digestione delle miofibrille per liberare i mitocondri che sono imbrigliati in esse, cioè appunto la popolazione IMF. Alla fine dell'incubazione la sospensione sarà omogeneizzata, filtrata attraverso un garza sterile e centrifugata a 3000 g per 10 minuti. Il pellet ottenuto sarà risospeso e centrifugato a 500 g per 10 minuti. Il surnatante contenente i mitocondri IMF sarà centrifugato a 3000 g per 10 minuti. Il pellet sarà lavato una sola volta e risospeso in un mezzo contenente 250 mM saccarosio, 50mM TRIS, pH 7.5, 0.1 % di BSA. MISURE EFFETTUATE SUI MITOCONDRI ISOLATI Una volta isolate le frazioni mitocondriali di fegato e di muscolo scheletrico su di esse saranno effettuate le seguenti misure per determinarne l'attività e l'efficienza: 1) Misura dell'attività respiratoria, 2) Misura del potenziale di membrana, 3) Misura della conduttanza protonica basale, 4) Misura della conduttanza protonica indotta, 5) Misura delle proteine trasportatrici coinvolte nella conduttanza protonica indotta dagli acidi grassi (trasportatore degli nucleotidi adeninici o ANT, e proteine disaccoppianti o UCP). 1.Misura dell'attività respiratoria. L'attività respiratoria sarà misurata nelle frazioni mitocondriali di fegato e di muscolo scheletrico polarograficamente con un elettrodo di Clark (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, Oh, USA). Le misure saranno realizzate in camere termostatate ad una temperatura di 30 °C utilizzando per i mitocondri di muscolo un mezzo di incubazione contenente 30 mM LiCl, 6 mM MgCl2, 75 mM saccarosio, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-PO4, pH 7.0, 0.1 % (p/v) di BSA libera da acidi grassi, mentre per i mitocondri di fegato sarà utilizzato un mezzo di incubazione contenente 80 mM LiCl, 50 mM Hepes, 1 mM EGTA, 5 mM Tris P, a pH 7.0, 0.1% (p/v) di BSA libera da acidi grassi. La capacità respiratoria mitocondriale sarà determinata in due diverse condizioni: Stato 3 e Stato 4. Lo Stato 3 della respirazione sarà determinato in presenza di ADP (ad una concentrazione finale 0.3 mM), per ottenere la massima capacità ossidativa mitocondriale, mentre lo Stato 4 sarà invece monitorato in assenza di ADP. 2. Misura del potenziale di membrana Il potenziale di membrana mitocondriale sarà misurato utilizzando la lettura spettrofotometrica (spettrofotometro JASCO a doppia lunghezza d'onda, 511-533 nm) di un colorante carico positivamente, la safranina O, la cui distribuzione è associata a variazioni dello spettro a secondo dello stato di energizzazione dei mitocondri. Le letture dell'assorbanza della safranina saranno trasformate in potenziale di membrana (mV) utilizzando l'equazione di Nernst: delta psi=61 mV·log ([K+]in / [K+]out ). Le curve di calibrazione saranno ottenute da tracciati in cui la concentrazione esterna di K+ ([K+]out) sarà fatta variare nel range tra 0.1-20 mM. La variazione di assorbanza dovuta all'aggiunta di valinomicina 3 µM, che è un trasportatore specifico del potassio, sarà plottata in funzione della ([K+]out ). La concentrazione di potassio interna sarà valutata per estrapolazione della retta di calibrazione a zero. 3. Misura della conduttanza protonica basale La conduttanza protonica basale sarà valutata determinando le variazioni del potenziale di membrana associate alle variazioni del consumo di ossigeno ottenute mediante la titolazione con quantità crescenti di malonato a partire dallo Stato 4 della respirazione in presenza di oligomicina e di succinato come substrato. Per poter determinare la conduttanza protonica basale sperimentalmente è possibile abolire il flusso di protoni attraverso l'ATP sintetasi di una sospensione mitocondriale utilizzando l'oligomicina, un antibiotico che inibisce l'ATP sintetasi prevenendo il passaggio di H+ attraverso l'F0. In queste condizioni, il consumo di ossigeno misurato serve solamente a bilanciare il flusso protonico passivo, quindi la respirazione è una misura della velocità del ciclo protonico in stato stazionario. La titolazione effettuata con il malonato a partire dallo stato 4 con l'oligomicina è una misura indiretta della conduttanza protonica mitocondriale, poiché la velocità del consumo di ossigeno (cioè la velocità di fuoriuscita dei protoni) nei mitocondri in condizione di non fosforilazione, è equivalente al flusso protonico in ingresso dovuto alla conduttanza protonica basale. La forza protonmotrice nello stato stazionario è fatta variare titolando con un inibitore del trasporto degli elettroni. Il grafico della respirazione in funzione della forza protonmotrice è quindi il classico grafico "v in funzione della [S]" della velocità del flusso protonico passivo in funzione del suo substrato. la forza protonmotrice. La titolazione dello Stato 4 della respirazione sarà eseguita mediante sequenziali aggiunte di malonato fino a 5mM in presenza di succinato (10mM), rotenone (3.75 µM), oligomicina (2 µg/ml), safranina O (83.3nmol/mg) e nigericina (80ng/ml). La nigericina è un scambiatore potassio/protoni ed è usato per eliminare la differenza di pH attraverso la membrana mitocondriale interna e permettere di esprimere l'intera forza protonmotrice come potenziale di membrana. 4. Misura della conduttanza protonica indotta da acidi grassi L'effetto disaccoppiante degli acidi grassi sarà misurato determinando la diminuzione del potenziale di membrana dello Stato 4 in presenza di succinato e oligomicina provocato dall'aggiunta di quantità fisiologiche di acido grasso libero, l'acido palmitico. Inoltre per una determinazione accurata della conduttanza protonica indotta, sarà valutata la risposta cinetica del potenziale di membrana mitocondriale al variare del consumo di ossigeno ottenuto diminuendo progressivamente le reazioni di ossidazione del substrato (succinato) del mitocondrio in presenza di oligomicina (per inibire la fosforilazione ossidativa) e di acido palmitico, aggiungendo un inibitore del trasporto di elettroni quale il malonato (inibitore specifico della succinico deidrogenasi). Il mezzo di incubazione e le procedure di titolazione sono le stesse utilizzate per la conduttanza protonica basale solo che le aggiunte sequenziali di malonato sono fino a 600 µM. 5. Misura dei trasportatori coinvolti nella conduttanza protonica indotta Il contenuto di ANT sarà determinato titolando lo stato 3 della respirazione con concentrazioni crescenti di carbossiatrattiloside (CAT), un inibitore specifico dell'ANT, usando succinato 10 mM e rotenone 3.75 µM come substrato. Il contenuto di ANT sarà determinato per estrapolazione della parte lineare della curva di titolazione per ottenere la quantità di CAT richiesta per inibire completamente lo stato 3. Il contenuto della proteina UCP3 verrà determinato mediante la tecnica di Western blotting. In particolare aliquote di proteine mitocondriali verranno denaturate e successivamente separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide al 12%, in presenza di SDS. Le proteine saranno poi trasferite su una membrana di PVDF, dove reagiranno con un anticorpo primario policlonale per l'UCP3 e poi con uno secondario. E' possibile infine quantificare la proteina di interesse, mediante l'utilizzo di un substrato chemioluminescente sensibile all'attività fosfatasica dell'anticorpo secondario. Dall'insieme dei studi condotti nelle diverse condizioni sperimentali si prevede di poter ottenere una più approfondita conoscenza dei meccanismi di regolazione della spesa energetica e dell'efficienza metabolica, che rappresenta un fondamentale punto di partenza per comprendere come una alterata regolazione di tali parametri possa condizionare lo stato di salute di un organismo. Ci si attende inoltre di poter arrivare a stabilire se l'efficienza metabolica mitocondriale rappresenti effettivamente un importante punto di controllo dell'omeostasi metabolica e se quindi sia possibile tentare di elaborare strategie applicative che mirino all'alterazione del metabolismo energetico mitocondriale come bersaglio terapeutico in condizioni di alterata omeostasi metabolica.