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Con il presente progetto si intende studiare il ruolo ed il meccanismo d'azione delle iodotironine nel danno epatico indotto da alcool su fegato steatosico. A tale scopo saranno utilizzati ratti sottoposti ad una dieta iperlipidica e sarà verificata la tolleranza alla somministrazione acuta di etanolo e valutato l'effetto protettivo delle iodotironine. Saranno inoltre valutati gli effetti delle iodotironine sulla capacità rigenerativa del fegato steatosico dopo epatectomia. 1) Dieta iperlipidica ed etanolo (etOH). Negli esperimenti saranno utilizzati ratti maschi adulti (8 settimane) forniti dalla ditta Charles River (Lecco, Italia) stabulati singolarmente in una stanza a temperatura e cicli di luce controllati (28° C e cicli di luce di 12 h). I ratti saranno alimentati con una dieta iperlipidica HFD (% di energia metabolizzabile 21 carboidrati, 29 proteine, 50 grassi J/J ; energia totale 19.85 KJ/g)o con una dieta colino-deficiente. Una parte degli animali sarà sottoposta ad una somministrazione intragastrica di etOH al 35% (v/v) ogni 12 h per 3 giorni. Gli altri ratti riceveranno una soluzione salina con somministrazione intragastrica agli stessi tempi. La dose finale di etOH sarà 4g/kg di peso corporeo e 6 h circa dopo l'ultimo trattamento con etOH o soluzione salina i ratti saranno sacrificati. Per ogni gruppo la metà dei ratti sarà anche giornalmente iniettata intraperitoneo con T2 (25 microg/100 g peso corporeo) o T3 (15 microg/100 g peso corporeo. Utilizzando campioni di sangue prelevati dai diversi gruppi di animali saranno valutati i livelli serici di alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), triglicerdi, colesterolo totale e proteine totali mediante un Autoanalizzatore clinico Hitachi 7170. I mitocondri saranno isolati mediante centrifugazione differenziale degli omogenati di fegato. Per verificare lo stato di epatotossicità verrà valutata la produzione mitocondriale di H2O2 monitorando l'incremento di fluorescenza dovuto all'ossidazione di p-idrossifenilacetato da parte di H2O2 in presenza di perossidasi di rafano (Hyslop & Sklar Anal Biochemistry 141, 280, 1984). Utilizzando i mitocondri isolati dal fegato degli animali dei diversi gruppi di trattamento verrà verificato con metodo spettrofotometrico il livello di malondialdeide, prodotto nella perossidazione lipidica (Hiroshi Ohkawa et al Anal. Biochemistry 95, 351, 1979). Dal momento che le cellule di Kupffer svolgono un ruolo critico nella mediazione delle risposte infiammatorie durante il danno epatico verranno valutati i livelli di citochine prodotte (TNF alfa, TNF beta, IL-6, IL-1B) così da verificare il grado di attivazione dei macrofagi del fegato nelle nostre condizioni sperimentali. 2) Dieta iperlipidica e rigenerazione epatica. Saranno utilizzati ratti di controllo o alimentati con dieta iperlipidica (HFD;% di energia metabolizzabile 21 carboidrati, 29 proteine, 50 grassi J/J ; energia totale 19.85 KJ/g), sottoposti ad epatectomia parziale e trattati intraperitoneo con T2 (25 microg/100 g peso corporeo) o T3 (15 microg/100 g peso corporeo). Dopo una somministrazione intraperitoneo di bromodesossiuridina (BrdU) alla dose di 50 mg/kg 1 h prima del sacrificio, la valutazione della sua incorporazione nei nuclei dei diversi campioni di fegato permetterà di verificare l'induzione della proliferazione cellulare stimando la quantità di cellule in DNA sintesi al momento del sacrificio (Michalopoulos GK, DeFrances MC Science 276, 60, 1997). Dal momento che precedenti osservazioni (Cesarone CF et al BBActa 1087, 241, 1990) hanno evidenziato che nella rigenerazione epatica accanto ad eventi precoci legati all' incremento della DNA sintesi e ad eventi tardivi legati ai processi di proliferazione si verificano anche variazioni dell'attività della poli(ADP-riboso) polimerasi I(PARP I), enzima nucleare che regola la struttura della cromatina in relazione a molteplici eventi biologici, sarà studiata anche l'eventuale modulazione di questo enzima nelle nostre diverse condizioni sperimentali. L'attività sarà valutata come 32P-NAD incorporato nei nuclei isolati dal fegato a diversi tempi dopo l'epatectomia (Cesarone CF et al Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, G1219, 2000). Dal fegato dei diversi gruppi di trattamento sarà infine estratto l'RNA totale (Chomczynski & Sacchi Anal Biochem 162, 156, 1987)e, mediante Northern blot, utilizzando sonde di cDNA specifiche sarà valutata la quantità di mRNA codificante per proteine il cui pattern di espresssione varia durante il processo rigenerativo (IGFBP-1, IGFBP-4, Demori et al Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 278, G384, 2000). Nelle diverse condizioni, mediante Western blot, verranno anche valutati i livelli di espressione delle cicline (D1, A , E, p21 ) legate alla rigenerazione epatica (Alisi et al. Cell Physiol. Biochem 13, 239, 2003), in quanto recentemente è stato osservato che la T3 influenza il loro pattern di espressione (Demori I, paper in preparazione).
