RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi molecolari e cellulari della protezione indotta dall'esercizio fisico

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - Esercizio fisico, salute ed attivita' sportiva - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Arsenio VEICSTEINAS

Descrizione

1 Scopi generali Gli scopi generali di questa UO nel progetto sono: (1) indurre uno stato di allenamento aerobico nel modello animale prescelto mediante l'applicazione di protocolli di esercizio fisico, e verificarne gli adattamenti in termini di risposta cardiocircolatoria; (2) valutare le modificazioni morfofunzionali indotte dall'allenamento 2 Obiettivi 2.1 Il protocollo di allenamento da utilizzare nei ratti è stato scelto al fine di riprodurre sul modello animale gli effetti indotti da un allenamento aerobico di tipo moderato su alcuni aspetti della funzionalità cardiovascolare, sull'adeguamento morfologico del tessuto miocardico e muscolare. L'intensità dell'allenamento, definita in base alle linee guida citate nella parte generale (2), al 60-70% del massimo consumo di ossigeno, appare soddisfare questa condizione. Sempre attenendosi alle stesse linee guida (2), sarà selezionata una frequenza di allenamento di 1 ora al giorno per 3 volte alla settimana. Al fine di monitorare gli adeguamenti cardiocircolatori, i ratti saranno caratterizzati con misurazioni di frequenza cardiaca a riposo e durante esercizio, prima e dopo un periodo di allenamento di 12 settimane. Tale durata e' stata stabilita in base ai risultati preliminari ottenuti dalla nostra UO, che mostrano una stabilizzazione del peso corporeo dopo tale periodo di allenamento (vedi figure 1 e 2). 2.2 L'obiettivo dei riscontri morfometrici sul muscolo è di stabilire se e come l'induzione dei fattori angiogenici si esprima in un fenotipo corrispondente alla formazione di nuovi capillari nella muscolatura scheletrica e cardiaca. Inoltre si vogliono tipizzare le fibre muscolari per valutare l'effetto dell'allenamento sulla selezione di particolari tipologie cellulari. 3 Metodi 3.1. Animali e valutazioni preliminari. Il modello animale scelto (ratto Sprague-Dawley maschio adulto di 8 settimane) è già stato utilizzato in numerosi lavori per la sua affidabilità e applicabilità all'uomo (5). E' inoltre possibile utilizzare un protocollo riproducibile per determinare il massimo consumo di ossigeno (5). Preliminarmente, alcuni animali sono già stati studiati dalla nostra UO prima e dopo allenamento. Al loro arrivo sono stati pesati e stabulati in gabbie singole con cibo in quantità definita , per la valutazione del consumo alimentare ed acqua "ad libitum", a temperatura ambiente di 20±2 °C e con cicli automatici luce-buio di 12 ore. Dopo una settimana di adattamento sono stati divisi a "random" secondo la tabella dei numeri casuali di Fisher in 2 gruppi sperimentali comprensivi ciascuno di 8 ratti. I rimanenti 4 animali sono stati tenuti di scorta per eventuali cambi nei primi giorni di allenamento. Si e' proceduto a un rigoroso sistema di ambientamento degli animali all'esercizio. L' allenamento veniva effettuato 3 volte la settimana negli stessi giorni ed ore ed il massimo carico di lavoro è stato definito in 1 ora alla velocità di 30 metri/ min , velocità che , per questo tipo di animale, corrisponde ad un esercizio moderato pari al 60% del massimo consumo di ossigeno (3). Una volta alla settimana si pesavano gli animali e si valutava il loro consumo alimentare. Risultati preliminari: La mortalità degli animali è stata del 5%, dovuta a cause estranee all' allenamento, legate alle normali incidenze patologiche del ceppo utilizzato. La figura 1 mostra la progressione dell'allenamento nel tempo durante lo studio preliminare (primavera 2003) e quella prevista per il presente progetto. La figura 2 mostra che durante gli studi preliminari il peso corporeo dei ratti allenati è risultato inferiore a quello dei controlli , raggiungendo differenze statisticamente significative dalla seconda settimana di allenamento in poi, così come il consumo di cibo. Il peso del cuore degli allenati non è mai risultato significativamente superiore a quello dei sedentari né come valore assoluto ne come valore relativo rapportato al peso, indicando che un allenamento moderato non induce ipertrofia cardiaca. La concentrazione plasmatica di malonil-dialdeide è risultata significativamente maggiore negli allenati, indicando un leggero aumento dello stress ossidativi. Per il presente progetto i ratti verranno stabulati in gabbie singole (22°C con un ritmo di 12 ore di luce + 12 ore di buio), ed alimentati ad libitum con dieta standard. Il peso degli animali e il quantitativo di acqua e cibo assunti saranno verificati settimanalmente. I ratti saranno preventivamente fatti correre su nastro trasportatore a velocità moderata per prendere confidenza con il tipo di esercizio richiesto. In seguito, saranno effettuati test incrementali per valutare il massimo carico di lavoro sostenibile. Mediante la registrazione della frequenza cardiaca si stabilirà il dispendio energetico in funzione del carico di lavoro, assumendo una relazione lineare tra frequenza cardiaca e consumo di ossigeno (5). 3.2. Prelievo e distribuzione materiale. I ratti saranno anestetizzati (Pentobarbital, 50 mg/Kg ip) e sacrificati secondo le norme dettate dalla "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes", e quelle della "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", pubblicate da US National Institutes of Health (NIH Publication No. 85/23, revised 1996). Saranno prelevati i seguenti tessuti: miocardio, muscolo scheletrico , fegato, lingua e sangue. I tessuti verranno congelati in azoto liquido e conservati a –80°C. In seguito, i campioni prelevati saranno distribuiti alle varie UO per le rispettive analisi. 3.3. Valutazioni morfometriche. I muscoli scheletrici verranno perfusi con una soluzione contenente glutaraldeide 6,25% in un buffer cacodilato di sodio 0,1 M (osmolarita' totale del fissativo: 1100 mosM, pH 7,4) per 10 minuti, usando la tecnica descritta da Mathieu-Costello (4). II muscoli saranno quindi escissi e riposti a 4°C in una soluzione contenente glutaraldeide fino all'esecuzione dell'analisi morfometrica. Con l'ausilio di riferimenti anatomici, una piccola sezione di muscolo verrà poi prelevata dalla porzione profonda a metà lunghezza del gastrocnemio mediale, da un'area con tipologia di fibre miste. Tutti i campioni saranno tagliati in piccole strisce longitudinali, disidratate e incluse in blocchi di resina. Quattro blocchi, provenienti da ciascun animale, saranno tagliati in 4 sezioni trasverse (1 micron di spessore) usando un LKB Ultrotome III e in seguito colorati (4). Con il microscopio ottico si effettuerà la misura dell'area della sezione traversa delle fibre, della densità capillare (numero capillari/area sezione traversa della fibra) e del numero di capillari intorno alla fibra, quali indici di capillarizzazione del muscolo. Stessa procedura sarà utilizzata per l'analisi di un campione di ventricolo sinistro. 3.4. Dosaggio del glicogeno muscolare. La determinazione di pro- e macro-glicogeno utilizzerà una metodica (1) che sfrutta il comportamento differenziale in presenza di acido perclorico (4%). Il proglicogeno, relativamente ricco in proteine, costituisce la frazione insolubile, mentre il macroglicogeno costituisce la frazione solubile. Pertanto, pro-glicogeno e macro-glicogeno saranno determinati nel precipitato e nel surnatante, rispettivamente, incubando le soluzioni per 3h a 100°C, e dosando il glucosio rilasciato con metodiche enzimatiche standard. 4 Programma sperimentale Il progetto si sviluppa in 2 fasi successive nelle quali le indagini effettuate saranno prevalentemente le stesse. Per ciascuna fase sono indicati in dettaglio le misurazioni che verranno effettuate (numero totale di animali previsti = 80). Fase 1. I ratti saranno suddivisi in 4 gruppi (n=10 per ciascun gruppo), per un totale complessivo di 40 animali. Inizialmente, gli animali saranno suddivisi in due gruppi (n=20 per ciascun gruppo), di cui uno sarà sottoposto ad allenamento e il secondo sarà costituito da animali di controllo. Sia il gruppo di controllo che quello dei ratti sottoposti ad allenamento sarà ulteriormente suddiviso come segue: a) n=10, destinati alle valutazioni molecolari; b) n=10, destinati al protocollo di resistenza a ischemia/riperfusione del cuore. Un numero equivalente di ratti di controllo non allenati sarà destinato alle medesime valutazioni. Fase 2. In questa fase si prevedono le medesime suddivisioni degli animali e valutazioni sperimentali osservate nella fase 1. Tuttavia, le indagini sperimentali saranno effettuate su ratti allenati dopo un mese di detraining. Dato l'elevato numero complessivo di animali da allenare e sacrificare, si richiederanno finanziamenti per un collaboratore tecnico e per l'acquisto di un secondo ergometro da allenamento. Bibliografia 1. Adamo KB and Graham TE. Comparison of traditional measurements with macroglycogen and proglycogen analysis of muscle glycogen. J Appl Physiol 84: 908-913, 1998. 2. Fletcher GF, Balady GJ, Amsterdam EA, Chaitman B, Eckel R, Fleg J, Froelicher VF, Leon AS, Pina IL, Rodney R, Simons-Morton DA, Williams MA, and Bazzarre T. Exercise standards for testing and training: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association. Circulation 104: 1694-1740, 2001. 3. Horcajada M, Coxam V, Davicco M, Gaumet N, Pastoureau P, Leterrier C, Culioli J, and Barlet J. Influence of treadmill running on femoral bone in young orchidectomized rats. J Appl Physiol 83: 129-133, 1997. 4. Mathieu-Costello O. Capillary tortuosity and degree of contraction or extension of skeletal muscles. Microvasc Res 33: 98-117, 1987. 5. Wisloff U, Helgerud J, Kemi OJ, and Ellingsen O. Intensity-controlled treadmill running in rats: VO(2 max) and cardiac hypertrophy. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H1301-1310, 2001.