RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Meccanismi molecolari e cellulari della protezione indotta dall'esercizio fisico

Università di riferimento

Università degli Studi di MILANO - MEDICINA, CHIRURGIA, ODONTOIATRIA - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Michele SAMAJA

Descrizione

1. Obiettivi. Gli obiettivi di questa UO sono: 1.1 Caratterizzare in termini di resistenza endogena all'ischemia miocardica gli animali allenati da UO—AV. 1.2 Studiare alcuni dei meccanismi molecolari che conferiscono tale resistenza. 1.3 Sostenere l'attività di altri gruppi utilizzando la tecnologia sviluppata. 2. Resistenza miocardica all'ischemia a basso flusso. Per testare l'ipotesi che l'esercizio fisico genera resistenza cardiaca all'ischemia, utilizzeremo come modello sperimentale il cuore di ratto isolato e per fuso. Il cuore, espiantato dall'animale anestetizzato (iniezione i.p. di tiopentale sodico eparinizzato), è perfuso in condizioni strettamente controllate, escludendo variabili quali i diversi tempi di ischemia e gravità dell'occlusione coronarica. Il cuore è stabilizzato a pieno flusso coronarico, esposto a ischemia a basso flusso, e riperfuso alle stesse condizioni della stabilizzazione. La resistenza all'ischemia è valutata rapportando vari parametri funzionali e metabolici, misurati durante il recupero, con lo stesso parametro misurato al termine della stabilizzazione. Questo modello, indubbiamente ristrettivo rispetto al cuore in vivo, consente di eliminare o saturare le variabili che non sono di interesse. I cuori sono denervati per escludere gli effetti del sistema neuro-umorale. Inoltre, essi sono perfusi con un mezzo che non contiene né sangue né eritrociti, eliminando gli effetti dell'infiltrazione linfocitaria, dell'accumulo dei neutrofili, dell'aggregazione piastrinica, e le alterazioni dell'equilibrio acido-base e dell'affinità dell'emoglobina per l'ossigeno. La temperatura è strettamente controllata (±0.5°C), il volume del palloncino intraventricolare è aggiustato per assegnare carichi costanti, ed il flusso coronarico è esattamente uguale in tutti i gruppi. 2.1. Metodi/protocolli in dettaglio. Il modello di perfusione del cuore di ratto è descritto nei dettagli altrove (Samaja, Casalini et al. 1994; Samaja, Motterlini et al. 1995). In breve, una soluzione ossigenata di cristalloidi (Krebs-Henseleit, con 2 mM calcio libero, 11 mM glucosio, pH 7.4, pressione parziale di ossigeno 670 mmHg, pressione parziale di diossido di carbonio 43 mmHg), è forzata tramite l'aorta (flusso=15 ml/min) nella circolazione coronarica. In questo studio, la condizione di ischemia sarà applicata esponendo il cuore per 60 min a ischemia a basso flusso (1.5 ml/min) e riperfondendolo per 30 min, tempo sufficiente per raggiungere una condizione stabile. Il cuore perfuso è mantenuto in vita e funzionale anche durante l'ischemia, simulando pertanto la situazione che avviene nella maggioranza dei pazienti che soffrono di malattie coronariche e insufficienza cardiaca. La performance cardiaca è misurata con l'utilizzo di due trasduttori di pressione, di cui uno collegato al palloncino intraventricolare per la misura di frequenza cardiaca e pressione diastolica e sistolica, e l'altro alla cannula di perfusione per la misura della resistenza vascolare. Il metabolismo cardiaco è monitorato mediante misura del consumo di ossigeno e rilascio di lattato nell'arteria polmonare. I vantaggi più sensibili di tale modello sono: (A) estrema accessibilità a metodiche di analisi biochimica, fisiologica, morfologica e di biologia molecolare; (B) monitoraggio continuo di emodinamica e metabolismo; (C) recupero del perfusato al termine del circolo coronarico per la misura del consumo di substrati e del rilascio di prodotti; (D) possibilità di assegnare carichi di lavoro e condizioni di ischemia ben definiti e riproducibili; (E) mantenimento delle interazioni metaboliche presenti in vivo; (F) selezione delle condizioni sperimentali più appropriate e controllabili indipendentemente dalla sopravvivenza dell'animale. 3. Hypoxia-inducible factor (HIF) è un eterodimero composto da una subunità alfa ed una beta (Semenza 1998). Mentre la subunità beta beta è un fattore costitutivo stabile (Wood, Gleadle et al. 1996), la subunità alfa è labile e rappresenta il fattore limitante nella costituzione del dimero (Huang, Gu et al. 1998). In condizioni aerobiche, HIF-1 alfa è rapidamente degradato da ubiquitina (tempo di semivita <5 min) (Sutter, Laughner et al. 2000), ma l'ipossia inibisce la degradazione (il tempo di semivita aumenta a parecchie ore) permettendo l'accumulo intracellulare di HIF-1 alfa (Gassmann and Wenger 1997) e la stabilizzazione del dimero (Wood, Gleadle et al. 1996). Il complesso costituito da HIF- 1 alfa, HIF-1 beta e altre proteine può regolare la trascrizione di alcune sezioni del DNA in mRNA legandosi al DNA (Wang, Jiang et al. 1995) e modificare l'espressione di numerose proteine e funzioni (Samaja 2001). Di interesse in questo progetto, esse includono vascular endothelium growth factor (VEGF) e l'angiogenesi (Ray, Estrada-Hernandez et al. 2000), come pure le proteine che inducono l'apoptosi. 3.1 Metodi/protocolli in dettaglio. L'espressione di HIF-1 alfa è misurata nel ventricolo sinistro di cuori non sottoposti a esperimenti di perfusione come pure in altri tessuti con metodi di immunoistochimica. I campioni sono rapidamente congelati in N2 liquido e conservati a -80°C. Sezioni di 5-mm di spessore sono ottenute in criomicrotomo (Leica CM1510, Nussloch, Germany), collocati su vetrini, fissati con formalina al 4% tamponata per 45 min a 4°C, lavati con PBS parecchie volte, incubati con siero di capra al 10% (Chemicon International, Temecula, CA) per 1 h mescolando gentilmente, con anticorpo monoclonale da coniglio diretto contro HIF-1 alfa (Santa Cruz Biotechnology) diluito 1:200 in siero di capra al 1.5% per 1 h a temperatura ambiente, seguito da incubazione overnight a 4°C con anticorpo secondario da capra coniugato con fluoresceina diretto contro l'anticorpo primario (Chemicon International), diluito 1:1500 in siero di capra 1.5% per 45 min a temperatura ambiente. I controlli negativi sono preparati sostituendo l'anticorpo primario con siero di capra 1.5%. I vetrini sono esaminati in un microscopio invertito a fluorescenza (Axiovert 25 CFL, Carl Zeiss, Göttingen, Germany) fornito di obiettivo 40x e filtri per fluoresceina (set 09, excitation BP 450-490, emission LP 515) o rodamina (set 15, excitation BP 546/12, emission LP 590). Le immagini sono acquisite con una telecamera a colori (AxioCam czv CD 4.0, Zeiss, Göttingen, Germany) e memorizzate in un PC. Per quantificare il segnale, le immagini sono analizzate con il software IPlab (Scanalytics, Inc., MA). Si seleziona il canale verde e si misura l'intensità del verde come somma delle intensità dei singoli pixel su tutta l'immagine. Per ogni sezione, sono selezionati 5 campi random (0.02 mm2 ciascuno). Si esegue la media delle intensità di verde che viene sottratta del valore misurato nei rispettivi controlli. L'espressione di HIF-1 alfa è espressa come (somma delle intensità dei pixel verdi)/(1060.02 mm2). Come esempio, le figure 1 e 2 mostrano l'espressione di HIF-1 alfa (intensità del colore verde) in un ventricolo sinistro di controllo e in un cuore di ratto esposto a ipossia cronica (livello di ossigeno pari a metà del normale) per due settimane. 4. Apoptosi. Processo cellulare con ruolo decisivo nell'eliminazione di singole cellule all'interno dei tessuti, l'apoptosi sarà valutata nel cuore per determinare se esiste una correlazione con la resistenza cardiaca all'ischemia. 4.1 Metodi/protocolli in dettaglio. Per la misura della frammentazione del DNA, usiamo il metodo TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-rhodamine nick end labeling) (Gavrieli, Sherman et al. 1992) coi kits ApopTag Red In Situ Apoptosis detection kit (Intergen, Oxford, UK). Per quantificare i nuclei TUNEL-positivi, l'immagine acquisita come descritto sopra è analizzata col software NIH Image. Cinque campi random (0.2 mm2 ciascuno) sono analizzati per ogni sezione. Si seleziona il campo rosso e si conta il numero di spots rossi utilizzando appropriati valori di cutoff. La procedura è verificata contro un metodo manuale. I dati sono riportati come numero di nuclei TUNEL-positivi per unità di area, dopo la sottrazione del valore di background ottenuto nei controlli negativi. Come esempio, le figure 3 e 4 mostrano il grado di apoptosi (spots rossi)) in un ventricolo sinistro di controllo e in un cuore di ratto esposto a ipossia cronica (livello di ossigeno pari a metà del normale) per due settimane. Siccome alcuni studi hanno messo in discussione il contrasto fra apoptosi e necrosi (Saraste and Pulkki 2000), valuteremo il danno cellulare necrotico determinando l'attività di lattico deidrogenasi e creatina kinasi nel perfusato con metodi UV. Inoltre, si userà il metodo del propidio ioduro quale ulteriore marker di necrosi cellulare (Ito, Schaarschmidt et al. 1997). Brevemente, una soluzione contenente il colorante vitale sarà iniettata nell'organo attraverso l'aorta e il tessuto sarà disposto su vetrino per l'analisi dell'immagine e la misura del colorante. 5 Misura dello stress ossidativo. 5.1 La concentrazione plasmatica di malondialdeide (MDA) è misurata col metodo di (Kawai, Kasashima et al. 1989). Il plasma scongelato (0.1 ml) è mescolato con 0.25 M NaOH (0.025 ml), la miscela è vortexed, incubata a 60°C per 30 min, raffreddata e centrifugata (14,000 rpm per 5 min). Il supernatante (100 ml) è mescolato con 10 M HCl (0.01 ml), 2.5 mM 2,4 di-nitrophenyl-hydrazine sciolta in 1 M HCl (0.05 ml) e lo standard interno 2-nitroresorcinol (0.967 mM in 0.01 M HCl, 0.02 ml). La miscela è vortexed e incubata per 1 h a temperatura ambiente al buio. Dopo centrifugazione (14,000 rpm per 5 min), il supernatante è filtrato (0.22 microm GV-Cat SJGVL04NS, Millipore, Bedford, MA) e iniettato (0.02 ml) in un apparecchio HPLC (Kontron Instruments, Milan, Italy) composto da una pompa e un rivelatore UV/Vis a lunghezza d'onda=310 nm. La colonna (250 x 4.6 mm, Hypersyl ODS-5, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) è eluita con una miscela contenente acetonitrile e 0.01 M HCl (45:55) a 1.5 ml/min. Lo standard interno e l'addotto formato nella reazione fra 2,4 di-nitrophenyl-hydrazine con MDA eluiscono 3.1 e 5.9 min dopo il picco del solvente,rispettivamente. La concentrazione di MDA è calcolata dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e quella del picco dello standard interno. La curva di calibrazione è lineare (R2=0.992, S.E.=0.0387) fino a 0.07 mM. I dati sono espressi come mmoles di MDA per litro di plasma. 5.2 Il livello di nitriti e nitrati (NOx) nel plasma è misurato per catalisi enzimatica accoppiata alla reazione di Griess (Verdon, Burton et al. 1995). L'enzyma nitrato riduttasi converte i nitrati in nitriti, che sono fatti reagire con 0.1% naphtyl -ethylene-diamine con produzione di un addotto colorato misurabile allo spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 540 nm. La concentrazione di NOx è calcolata mediante una curva di calibrazione. 6 Misure biochimiche in supporto all'attività di altri gruppi dello stesso progetto. 6.1 Attività enzimatica di superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase e l'isoforma endoteliale di NO sintasi con metodi spettrofotometrici, 6.2 Glutatione ridotto (GSH) e ossidato (GSSG) mediante metodi di riciclo enzimatico, con uso di glutathione reductase per la quantificazione del glutatione totale. Stiamo sviluppando un protocollo alternativo per differentiare fra GSH e GSSG. 6.3 Vascular endothelial growth factor (VEGF) e VEGF-receptor-2 (VEGFR-2) mediante immunoistochimica. VEGF è una glicoproteina (45 kDa) che promuove la crescita delle cellule endoteliali e rappresenta un importante fattore di sopravivenza in vivo e in vitro. Sono state identificate 4 isoforme di VEGF con 3 diversi recettori (Ferrara, Gerber et al. 2003), ma la via attraverso VEGFA e VEGR-2 sembra il maggior mediatore degli effetti mitogenici, angiogenici e di aumento di permeabilità di VEGF. 7. Collaborazioni all'interno del progetto. Alcune problematiche descritte nel progetto saranno approfondite ed integrate con la collaborazione diretta delle UO afferenti al progetto generale. UO-AV: Oltre a fornire gli animali oggetto dello studio, la collaborazione con la UO-AV si articolerà con determinazioni di markers di danno tissutale (malonildialdeide nel plasma) e pro- e macro-glicogeno (forme di glicogeno con significati biologici differenti secondo il contenuto relativo in glicogenina) come markers della condizione di esercizio UO-MM: Le tecniche di determinazione di apoptosi e necrosi mediante l'uso di propidio ioduro, Hoechst 3342 e morfologia della cromatina nucleare saranno rese operative con la collaborazione della UO-MM. 8. Bibliografia essenziale Ferrara, N., H. P. Gerber, et al. (2003). "The biology of VEGF and its receptors." Nat Med 9(6): 669-76. Gassmann, M. and R. Wenger (1997). "HIF-1, a mediator of the molecular response to hypoxia." News Physiol Sci 12: 214-218. Gavrieli, Y., Y. Sherman, et al. (1992). "Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation." J Cell Biol 119: 493-501. Huang, L., J. Gu, et al. (1998). "Regulation of hypoxia - inducible factor 1 alpha is mediated by an oxygen - dependent degradation domain via the ubiquitine - proteasome pathway." Proc Natl Acad Sci USA 95: 7987-7992. Ito, W., S. Schaarschmidt, et al. (1997). "Infardt size measurement by triphenyltetrazolium chloride staining versus in vivo injection of propidium iodide." J Mol Cell Cardiol 29: 2169-2175. Kawai, S., K. Kasashima, et al. (1989). "High-performance liquid chromatographic determination of malondialdehyde in serum." J Chrom 495: 235-238. Ray, P., T. Estrada-Hernandez, et al. (2000). "Early effects of hypoxia - reoxygenation on VEGF, ang-1, ang-2 and their receptors in the rat myocardium: implications for myocardial angiogenesis." Mol Cell Biochem 213: 145-153. Samaja, M. (2001). "Hypoxia - dependent protein expression: erythropoietin." High Alt Med Biol 2: 155-163. Samaja, M., S. Casalini, et al. (1994). "Regulation of bioenergetics in O2-limited isolated rat hearts." J Appl Physiol 77: 2530-2536. Samaja, M., R. Motterlini, et al. (1995). "Myocardial metabolism and function in acutely ischemic and hypoxemic isolated rat hearts." J Mol Cell Cardiol 27: 1213-1218. Saraste, A. and K. Pulkki (2000). "Morphological and biochemical hallmarks of apoptosis." Cardiovasc Res 45: 528-537. Semenza, G. (1998). "Hypoxia - inducible factor 1 and the molecular physiology of oxygen homeostasis." J Labor Clin Med 131: 207-214. Sutter, C., E. Laughner, et al. (2000). "Hypoxia - inducible factor 1alpha protein expression is controlled by oxygen - regulated ubiquination that is disrupted by deletions and missense mutations." Proc Natl Acad Sci USA 97: 4748-4753. Verdon, C., B. Burton, et al. (1995). "Sample pretreatment with nitrate reductase and glucose-6-phosphate dehydrogenase quantitatively reduces nitrate while avoiding interference by NADP+ when the Griess reaction is used to assay for nitrate." Anal Biochem 224: 502-508. Wang, G., B. Jiang, et al. (1995). "Hypoxia inducible factor 1 is a basic helix-loop-helix PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension." Proc Natl Acad Sci USA 92: 5510-5514. Wood, S., J. Gleadle, et al. (1996). "The role of the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation (ARNT) in hypoxic induction of gene expression. Studies in ARNT-deficient cells." J Biol Chem 271: 15117-15123.