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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
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Programma di ricerca

Meccanismi molecolari e cellulari della protezione indotta dall'esercizio fisico
Università di riferimento
Università degli Studi di BOLOGNA - Istologia ed embriologia generale - BOLOGNA(BO)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Marina MARINI
Descrizione
Scopo: Comprendere i meccanismi molecolari per cui l’esercizio fisico moderato favorisce salute e longevità. Proposta sperimentale:Valutare l’espressione dell’mRNA di geni dello stress e della tossicità in vari organi e tessuti di ratti allenati e di controllo; valutare l’attivazione di alcune vie di segnalazione connesse all’esercizio fisico. Protocollo sperimentale: Animali e fasi sperimentali. Gli animali verranno preparati e forniti dall’U.O. Veicsteinas. e condivisi con le altre U.O. I gruppi, come dettagliato nel progetto generale, saranno i seguenti: Fase I – a) allenati, in base a un protocollo di allenamento moderato non competitivo della durata di 12 settimane; b) sedentari. Fase II – a) allenati, dopo 4 settimane di sospensione dell’allenamento, b) sedentari, di pari età. I gruppi sperimentali saranno costituiti da almeno 8 animali ciascuno. Un’ulteriore fase, che potrà avere inizio appena disponibili i primi risultati relativi alla fase I, consisterà nello studio delle vie di segnalazione e nella valutazione del prodotto proteico (tramite Western blotting) relativi a eventuali geni che risultassero attivati. Tessuti. Cuore. Muscoli scheletrici coinvolti nell’allenamento (soleo, estensore e plantare). Muscolo scheletrico non coinvolto nell’allenamento (lingua). Aorta come fonte di muscolatura liscia. Mononucleati del sangue periferico. Fegato. Metodi. 1. Preparazione Gli animali saranno sacrificati per dislocazione cervicale; da ciascuno verranno prelevati almeno 5 mg da ciascuno dei tessuti da studiare, che verranno immediatamente congelati in azoto liquido. Il sangue sarà prelevato per puntura cardiaca, verrà aggiunto EDTA, e verrà separato con gradiente di Ficoll per ottenere i mononucleati, che verranno poi congelati in azoto liquido come gli altri tessuti. Il plasma verrà conservato anch’esso dopo congelamento rapido e utilizzato per valutazioni biochimiche. I tessuti congelati saranno polverizzati in mortaio; una parte della polvere sarà conservata per l’estrazione delle proteine, una parte verrà utilizzata per estrarre RNA per mezzo della Workstation ABI PRISM 6700. Prima dell’utilizzo dell’RNA, si valuterà l’eventuale presenza di tracce di DNA, amplificando con la PCR un introne; le preparazioni di RNA contenenti DNA verranno trattate con DNAsi e nuovamente controllate; l’integrità dell’RNA verrà esaminata valutando le bande 28S e 18S in un Northern gel. 2. Macroarrays. Dopo retrotrascrizione e coniugazione con UDP-biotina, il cDNA verrà ibridizzato su una membrana ottenuta commercialmente, che porta immobilizzati 96 geni dello stress e della tossicità e 16 di controllo. Le sequenze di DNA murino sono state scelte in modo da ibridizzare in maniera stringente con cDNA di ratto corrispondente. 2.1 Geni che saranno esaminati. I geni legati alla membrana ricadono nelle seguenti classi: a) 5 geni coinvolti nella risposta mitotica: ciclina C, ciclina D1, ciclina G, E2F-1 egr-1, PCNA; b) 7 geni coinvolti nell’arresto mitotico: p21Waf1/p21Cip1, GADD153, GADD45, GADD45-beta, Insulin-like growth factor binding protein 6, MDM-2, p53; c) 11 geni della segnalazione dell’apoptosi: annessina V, Bax, Bcl-X, Bcl-W, Caspasi-1/ICE, Caspasi-8/FLICE, IκBa/MAD3, TNF-R1, Fas Ligand, TRAIL, Tradd; d) 30 geni coinvolti nella risposta allo stress ossidativo e metabolico: alpha-crystallin-B, 12 diverse isoforme di citocromo p450 (Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp1b1, Cyp2a5; Cyp2b10; Cyp 2b9; Cyp2c29; Cyp3a11, Cyp4a10, Cyp4a14, Cyp7a1, Cyp7b1), EphX2 (epossido-idrolasi-2), monossigenasi 1, monossigenasi 4, monossigenasi 5, glutatione perossidasi 1, glutatione perossidasi 2, glutatione reduttasi, glutatione S-transferasi 1, glutatione S-transferasi 3, eme ossigenasi 1, eme ossigenasi 2, Metallotioneina 1-attivatore, metallotioneina 2, NADPH-citocromo p450-ossidasi, cox-2, SOD1, SOD2; e) 12 geni dello stress termico: HSP40, Heat Shock Factor-1, HSP25, HSP60, HSP70-1, HSP105, HSP70 1l, HSP70 4, GRP78, HSPa8, HSPa9, chaperonina 10; f) 14 geni indotti dal danno al DNA e della riparazione: ATM, Excision repair complementation group 1, Excision repair complementation group 2, Excision repair complementation group 4, Excision repair complementation group 5, RAD 23a, RAD 50, Ch2-kinasi, UGTBr/p, Uracil-DNA glicosilasi, X-ray repair complementing group 1, X-ray repair complementing group 2, X-ray repair complementing group 4, X-ray repair complementing group 5; g) 16 geni dell’infiammazione: GM-CSF, Il-1a, Il-1b, Il-6, Il-18, TNF-beta, MIF (Migration Inhibitory Factor), NFκB-1, iNOS, Small inducile cytokine A21a, Small inducile cytokine a21b, Small inducile cytokine a21c, MIP (Macrophage Inhibitory Protein), MIP-1b, Interferon-gamma induced protein CRG-2, Serpine 1 (inibitore dell’attivatore del plasminogeno). È opportuno sottolineare che la scelta di tali geni è stata dettata anche dal fatto che essi sono regolati, almeno in parte, a livello di trascrizione. 2.2 Ulteriori indagini di espressione genica Nei tessuti in cui si dimostrasse che l’allenamento induce alterazioni dell’espressione genica, ci si propone di ampliare lo studio a un panel di geni specifico per il tessuto di interesse. A tale scopo riteniamo di utilizzare il robot che è già disponibile presso l’Istituto. 2.3 Analisi dei dati dei macroarrays I dati verranno sottoposti ad analisi statistica multivariata, eventualmente alla luce della teoria dei network complessi (Ravasz E, Somera AL, Mongru DA, Oltvai ZN, Barabasi AL. Hierarchical organization of modularity in metabolic networks. 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Vie di segnalazione indotte da esercizio fisico L’attivazione delle vie della CaM kinasi, della AMP.activated kinasi e della MAP (K) kinasi verrà valutata studiando la fosforilazione di proteine target, mediante l’uso di anticorpi specifici. I risultati serviranno come base per ulteriori studi di espressione genica (vedi 2.2). Prodotti attesi Pubblicazione di articoli scientifici su riviste specializzate; addestramento di giovani ricercatori. Se verrà identificato un prodotto genico valutabile nei mononucleati o nel plasma che possa costituire un indice dello stato di allenamento o un predittore di protezione, si intende studiarne eventuali applicazioni commerciali, sia biotecnologiche (messa a punto di kit per il suo dosaggio), sia farmacologiche (messa a punto di farmaci che possano indurre uno stato di protezione in individui impossibilitati all’esercizio fisico).