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SCIENZE ANATOMICHE UMANE E FISIOPATOLOGIA DELL'APPARATO LOCOMOTORE - BOLOGNA(BO)
Il presente progetto si propone di analizzare la risposta dei tessuti connettivi sottoposti a differenti sollecitazioni funzionali. In particolare si propone: A) di analizzare le modificazioni biochimiche e strutturali della matrice connettivale in tessuti sottoposti a stretching al fine di controllare eventuali disordini strutturali e quindi di prevenire patologie; B) di studiare il comportamento della matrice connettivale a contatto con superfici metalliche (differenti per micromorfologia superficiale) durante la pratica della ricostruzione chirurgica (in campo ortopedico ed odontoiatrico) . A) Poiché scarsissime sono le ricerche in questa direzione (in particolare riguardanti la componente tendinea), si ritiene opportuno iniziare una ricerca sperimentale di base su animale adottando le seguenti linee di ricerca: 1) Individuare le possibili modificazioni strutturali e biochimiche, nonché l'entità delle stesse, che si verificano nelle componenti cellulari ed extracellulari dei tendini quando siano sottoposti a stiramento periodico. 2) Verificare se tali modificazioni compaiano già dopo una prima applicazione della forza di stiramento o solo con la ripetizione della stessa nel tempo (training). 3) Verificare se tali modificazioni siano reversibili nel caso si sospendano definitivamente gli esercizi di allungamento muscolo-tendineo. Gli esperimenti verranno condotti in vivo su 30 ratti Sprague Dawley utilizzando un tutore in resina, che consenta la misurazione con un dinamometro dell'entità dello stiramento. Tale tutore verrà applicato all'arto posteriore destro sottoponendo a stiramento passivo il muscolo gastrocnemio e il relativo tendine di Achille (calcaneale) mediante dorsoflessione del piede. La posizione di massimo stiramento verrà mantenuta per 10'; si procederà con una applicazione giornaliera del tutore per un periodo della durata di 4 settimane. L'arto controlaterale fungerà da controllo. I tendini (trattati e non) verranno resecati e processati con metodiche diversificate per analisi biochimiche e osservazioni morfologiche in Microscopia a luce polarizzata (LM) e in Microscopia elettronica a Trasmissione (TEM) e a Scansione (SEM). I campioni destinati all'analisi al microscopio a luce polarizzata verranno fissati in formaldeide al 10%, disidratati nella serie ascendente degli alcoli e inclusi in paraffina. Le sezioni saranno colorate con Sirius Red per incrementare la naturale birifrangenza delle fibrille collagene. I campioni destinati all'analisi al TEM verranno fissati con soluzione Karnovsky (paraformaldeide 4% + glutaraldeide 2.5% in tampone cacodilato 0.1M a pH 7.2-7.4), quindi postfissati in tetrossido di osmio, disidratati nella serie ascendente degli alcoli e inclusi in Araldite. Le sezioni fini ottenute verranno raccolte su retini rivestiti con Formwar, contrastate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate al TEM sotto una tensione di 80 kV. I campioni destinati al SEM saranno sottoposti a macerazione secondo il metodo Ohtani, per metterne in evidenza la rete tridimensionale e l'andamento delle fibrille collagene, quindi verranno postfissati in tetrossido di osmio all'1%, disidratati nella serie ascendente degli alcoli ed essiccati con esametildisilazano (HDMS). Infine i campioni saranno montati su stubs tramite carbone bioadesivo e metallizzati con un film di 20 nm di spessore di oro-palladio ed osservati sotto una tensione di 15 kV. In linea con gli obiettivi che si prefigge questa Ricerca, verranno rilevati i seguenti parametri morfologici: modificazioni macroscopiche (calibro e lunghezza) dei tendini sottoposti a stiramento; modificazioni ultrastrutturali tendinee (diametro e bandeggio delle fibrille collagene, densità e grado di allineamento delle fibrille - crimps -); determinazione della OH-prolina marcata quale indicatore di un eventuale processo di neofibrillogenesi. B) Nella chirurgia ortopedica ricostruttiva, risulta molto importante ottenere nel breve periodo un rapido e buon ancoraggio dell'impianto al tessuto ospite perimplantare. Per molti anni la composizione dei biomateriali e la topografia di superficie sono stati oggetto di studio in quanto implicati nei fenomeni di adesione cellulare e riorganizzazione del citoscheletro con effetti a lungo termine su maturazione cellulare e successiva mineralizzazione. Attualmente si tende ad evidenziare come l'interazione fra biomateriale e cellule del tessuto ospite sia in realtà mediata da costituenti della matrice cellulare (ECM) adsorbiti sulla superficie implantare stessa. Allo scopo di valutare il ruolo che l'ECM ha nel mediare l'adesione cellulare al biomateriale, s'intende esaminare in vitro la risposta dei diversi tipi cellulari coinvolti nel processo di osteogenesi (osteoblasti, cellule staminali mesenchimali, cellule endoteliali) a differenti tipi di rugosità superficiale e contemporaneamente valutare in vivo se tali topografie superficiali possano avere un ruolo nell'ancoraggio delle superfici implantari all'osso. Per quanto riguarda le ricerche sperimentali in vitro verranno utilizzati 72 dischetti in titanio (cpTi-OR-Vit Bologna) sottoposti a differenti trattamenti superficiali: 12 SS (superficie tornita a macchina) Ra = 0.5µm 12 TPS (superficie trattata con la tecnica del plasma-spray) Ra = 7.6 µm 12 SLA (superficie sabbiata con ossido di zirconia ) Ra = 1.7µm 12 SLA (superficie sabbiata con ossido di zirconia ) Ra = 1.3µm 12 SLA (superficie sabbiata con allumina) Ra = 1.6µm 12 SLA (superficie sabbiata con allumina) Ra = 1.4µm I dischetti verranno caratterizzati preliminarmente mediante rugosimetro (per la valutazione della rugosità superficiale) e spettroscopia Raman (per la valutazione di eventuali impurità superficiali). Successivamente essi saranno immersi nel mezzo di coltura cellulare (DMEM) addizionato con siero fetale bovino (FBS) al 10% e dopo 3-6-12-24 ore verrà valutato l'adsorbimento proteico alla superficie dei dischetti. Ciascun tipo cellulare utilizzato (osteoblasti, cellule staminali mesenchimali, cellule endoteliali) verrà piastrato su 4 dischetti per ogni gruppo: una metà delle cellule sarà posta in coltura con DMEM + FBS e all'altra metà sarà addizionato il dexametasone (Dex), che è un agente di mineralizzazione. Dopo 24 ore, 6 giorni e 12 giorni su alcuni campioni verranno valutati i seguenti parametri: adesione e proliferazione cellulare, attività ALP-asica, produzione di collagene tipo I, produzione di osteocalcina, produzione di osteoprotegerina e formazione di noduli di mineralizzazione (bone-like nodules). Altri campioni verranno invece processati per l'osservazione al Microscopio elettronico a Scansione per la valutazione delle caratteristiche strutturali delle cellule: dopo essere state delicatamente risciacquate con PBS, le cellule saranno fissate con soluzione Karnovsky (paraformaldeide all'1%, glutaraldeide all'1.5% in tampone cacodilato 0.1M) per 30', quindi i dischi con le cellule ad essi adese verranno risciacquati 3 volte con tampone cacodilato 0.1M, post-fissati per 30' con tetrossido di osmio all'1%, disidratati nella serie ascendente degli alcoli ed essiccati con esametildisilazano (HDMS) per 5'. Per ciò che riguarda le ricerche sperimentali in vivo verranno complessivamente usati 96 impianti dentali a vite conica in titanio (cpTi OR-Vit -Bologna) con i 6 medesimi trattamenti superficiali. Per testare tali impianti verranno utilizzate 4 pecore mongrel. Gli impianti verranno inseriti in femore e tibia di ogni animale e prelevati dopo 14 giorni , 1 mese, 3 mesi e 6 mesi dall'intervento. I campioni prelevati verranno in parte processati per la microscopia ottica e in parte per la Microscopia elettronica a Trasmissione e a Scansione tramite differenti sonde SEM, BSE ed EDAX al fine di seguire nel tempo l'andamento del processo di osteointegrazione.
