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L'ambito in cui si colloca il presente progetto è lo studio di interazioni intermolecolari tra componenti abbondanti delle matrici extracellulari (ECM) dei tessuti connettivi, e cioè collageni fibrillari ed i piccoli proteoglicani ricchi in leucina (SLRPs) decorina (DCN), fibromodulina (FM) e biglicano (BGN), strutturalmente e funzionalmente correlati. I componenti di entrambe le famiglie sono multifunzionali. Quanto qui proponiamo costituisce l'estensione di studi precedenti del nostro gruppo nell'ambito delle interazioni tra DCN e collageni fibrillari e di analoghi studi in corso che coinvolgono FM, come riportato nel capitolo iniziale (Base di partenza). Per comprendere fenomeni biologici complessi occorre sezionare i fenomeni studiati. Il modello sperimentale da noi sfruttato in studi precedenti – che è la base del presente progetto – sfrutta il dissezionamento delle componenti collageniche con un duplice approccio: innanzitutto, la frammentazione specifica di collageni di tipo I e II per ottenere peptidi CNBr, che sono già stati ben caratterizzati; in secondo luogo, l'utilizzo di collageni e loro peptidi dopo modifiche chimiche eseguite in condizioni blande che non alterano la forma fisiologica a tripla elica collagenica o non impediscono il refolding dei peptidi CNBr a specie trimeriche con la stessa conformazione. Le implicazioni ed i risultati ottenuti per entrambi questi aspetti metodologici sono stati discussi nel capitolo iniziale. Nel presente progetto, utilizzando gli approcci appena descritti, ci proponiamo due mete nell'ambito degli studi di binding tra collageni fibrillari e SLRPs. Innanzitutto intendiamo ampliare gli SLRPs studiati utilizzando il biglicano. Tale SLRP è in grado di legare collageni, ed anche di competere con DCN per il binding a collageni usando quindi siti identici o adiacenti [19]. La letteratura per i biglicano è comunque più scarsa che non per DCN. In secondo luogo, intendiamo utilizzare peptidi di sintesi per restringere e meglio localizzare i siti delle molecole collageniche che legano gli SLRPs. In questa parte del progetto riteniamo utile ri-coinvolgere DCN e FM. I peptidi di sintesi da utilizzare vanno opportunamente disegnati per diverse caratteristiche: la sequenza deve contenere lisina, che nostri studi precedenti indicano come coinvolta nell'interazione con DCN e FM; in secondo luogo, i peptidi sintetizzati devono essere in grado di dare refolding a specie trimeriche aventi conformazione a tripla elica. Di questi criteri guida si è dato più ampio cenno nel capitolo iniziale. Il lavoro sperimentale si articolerà come qui di seguito descritto su entrambi gli anni del progetto. 1. PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEGLI SLRPs La prima e assoluta esigenza per la purificazione degli SLRPs è l'assenza di agenti caotropici che possono irreversibilmente denaturare la porzione proteica. Tessuti animali come sorgente sono perciò preclusi per DCN e BGN, mentre la FM può essere purificata da tessuti bovini (in particolare dal tendine) in condizioni native. Come sorgente di DCN e BGN utilizzeremo una linea cellulare opportunamente trasfettata in modo stabile con un vettore di espressione specifico che contiene la sequenza umana di DCN o la sequenza umana di BGN. Tali linee cellulari specifiche sono già a nostra disposizione; in particolare, è già stata eseguita selezione clonale delle linee trasfettate ed abbiamo a disposizione cloni che stabilmente sintetizzano e secernono nel mezzo di coltura DCN come proteoglicano in forma nativa; in modo analogo dei cloni per BGN. Gli SLRPs ricombinanti verranno purificati dal mezzo di crescita delle colture cellulari clonali mediante gli approcci usuali utilizzati nell'ambito, e cioè una sequenza di stadi cromatografici per scambio ionico e gel filtrazione. La FM verrà purificata da tendine bovino con una procedura, da noi già utilizzata, descritta in letteratura [20]. Come abbiamo già operato in passato, la caratterizzazione degli SLRPs ottenuti riguarderà aspetti di base come la composizione delle porzioni proteiche e delle catene di glicosaminoglicano (GAG), la sequenza proteica N-terminale, la massa molecolare del proteoglicano intero e del core proteico; determinazioni più specifiche riguarderanno la conformazione e la sua stabilità termica (mediante spettroscopia per dicroismo circolare) e la determinazione del grado di solforazione dei GAG a condroitin/dermatan solfato mediante l'analisi dei disaccaridi ottenuti con enzimi specifici [6]. Nel caso si rendesse necessario, abbiamo le facilities per l'utilizzo di traccianti radioattivi, ed operare per marcatura metabolica dei cloni che esprimono DCN o BGN e purificazione e analisi di questi due SLRPs marcati. Ciò ovviamente permette alta sensibilità. Questa parte del progetto richiede ovviamente una quantità significativa di tempo e lavoro. Inoltre, aspetti della caratterizzazione degli SLRPs, quale in particolare la definizione della composizione disaccaridica della decorina, verranno applicati al materiale tendineo dopo stretching fornitoci dall'Unità di Bologna. 2. COLLAGENI, PEPTIDI COLLAGENICI E MODIFICAZIONI CHIMICHE Come riportato nel capitolo iniziale, abbiamo esperienza di collageni fibrillari, di loro frammenti specifici (peptidi CNBr) e di modificazioni chimiche dei collageni/peptidi. Verranno perciò utilizzati collageni di tipo I e II (collageni I acido solubile e pepsinizzato, collagene II pepsinizzato), già a nostra disposizione e caratterizzati, e loro peptidi CNBr, anch'essi già ben caratterizzati in passato. Saranno necessarie ulteriori purificazioni di peptidi. Altri collageni fibrillari, come il tipo III ed il tipo V sono disponibili commercialmente. In modo analogo abbiamo conoscenza delle derivatizzazioni chimiche eseguite in condizioni blande di molecole collageniche e delle proprietà dei collageni e loro peptidi chimicamente modificati. Peptidi sintetici verrano disegnati sulla base di quanto è stato sopra riportato. Per la sintesi vera e propria si ricorrerà ad una company che fa tali servizi. La caratterizzazione dei peptidi sintetici sarà simile a quanto effettuato da noi in passato sui peptidi CNBr e verterà soprattutto sulla capacità di formare in vitro la specie trimerica avente tipica conformazione collagenica a tripla elica (rilevabile da un caratteristico spettro di dicroismo circolare) e sulla temperatura di denaturazione dei trimeri in condizioni fisiologiche. 3. STUDI DI INTERAZIONE TRA COMPONENTI COLLAGENICI E SLRPs Gli esperimenti di binding saranno eseguiti mediante saggio in fase solida (dosaggio Elisa), secondo un protocollo da noi messa a punto ed utilizzato in passato per DCN e FM, e cioè utilizzando le preparazioni degli SLRPs dopo biotinilazione; la quantizzazione verrà eseguita utilizzando avidina coniugata con fosfatasi alcalina [6]. L'affinità degli SLRPs nei confronti delle molecole collageniche – collageni interi, loro peptidi CNBr, peptidi di sintesi, molecole collageniche chimicamente modificate – può essere misurata utilizzando quantità crescenti degli SLRPs. Un plot secondo Scatchard permette di determinare la costante di dissociazione. Quando è richiesta elevata sensibilità utilizzeremo DCN e BGN radioattivi ottenuti per marcatura metabolica, come sopra accennato; la loro quantità verrà determinata mediante conteggio di scintillazione in fase liquida.
