RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

CANALI IONICI ATTIVATI DALL'IPERPOLARIZZAZIONE DEL POTENZIALE E REGOLATI DA NUCLEOTIDI CICLICI(CANALI HCN).

Università di riferimento

Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati di TRIESTE - SETTORE BIOFISICA - GRIGNANO(TS)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Vincent Aldo TORRE

Descrizione

L'interesse scientifico principale dell'Unità di Ricerca della SISSA-Torre verte alla comprensione dei meccanismi molecolari che stanno alla base del meccanismo di "gating", ovvero dell'apertura e della chiusura dei canali HCN in funzione del potenziale di membrana e della regolazione da parte dei nucleotidi ciclici. L'UdR della SISSA-Torre affiancherà esperimenti di elettrofisiologia allo sviluppo di un modello molecolare della struttura dei canali HCN. Lo scopo di questa modelizzazione è di fornire una spiegazione del gating nei canali HCN ed della loro regolazione da parte dei nucleotidi ciclici. Piu' specificamente, l'Unità di Ricerca SISSA-Torre si propone i seguenti tre obiettivi: 1 - compiere esperimenti di elettrofisiologia su canali selvaggi e mutati per ottenere Informazioni sperimentali sui cambiamenti conformazionali durante il gating. In particolare verranno studiati il canale HCN2 ed il canale HCN presente nello sperma del riccio di mare (SpHCN). 2 - studiare in dettaglio la specificita' del sito di legame per I nucleotidi ciclici dei canali HCN2 e SpHCN, mediante esperimenti di elettrofisiolgia e simulazioni di dinamica molecolare basate sulla struttura tridimensionale recentemente determinata ( Zagotta et al 2003 ) 3 - sviluppare un modello del canale HCN, comprendente il dominio citoplasmatico ed il dominio transmembranico comprendente I domini S4,S5 ed S6 ed il poro stesso. Tale modello servirà alla costruzione di modelli di gating. 1 – esperimenti di elettrofisiologia Gli esperimenti di elettrofisiologia si baseranno sulla Cysteine Scanning Mutangenesis, mediante la quale ciascun residuo viene sostituito con una cisteina. Il costrutto mutante del canale verrà utilizzato per esperimenti di elettrofisiologia in cui il RNAmessaggero del canale mutato viene iniettato in un oocita di Xenopus laevis. Dopo l'espressione del canale mutato nella membrana plasmatica dell'oocita, esso verrà studiato con esperimenti di elettrofisiologia. In questi esperimenti l'accessibilità ed altre proprietà della cisteina introdotta verranno studiate misurando l'effetto bloccante del cadmio e altri reagenti sulfidrilici quali il MTSET,MTSES ed MTSEA. La formazione di ponti S-S tra le cisteine introdotte selettivamente verrà seguita ed eventualmente indotta da composti ossidanti (Mazzolini et al 2002). Questa analisi cercherà di determinare effetti diversi nelle condizioni in cui il canale e' chiuso e quando il canale e' aperto. Per aprire il canale sara' necessario iperpolarizzare il potenziale di membrana e possibilmente aggiungere cAMP. Verranno studiati due canali HCN ovvero il canale HCN2 ed il canale SpHCN. Il canale SpHCN verra' studiato poiche' su di esso sono gia' state compiute diverse analisi con la stessa metodologia ( Roncaglia et al 2002; Rothberg et al 2002 & 2003 ). Estenderemo i risultati precedentemente ottenuti ( Roncaglia et al 2002; Rothberg et al 2002 & 2003 ) allo scopo di mappare i cambi conformazionali che avvengono nella regione del poro e nei segmenti transmembrana S4,S5 e S6 adiacenti. In particolare: - valuteremo i due linker tra i segmenti transmbrana S4-S5 e S5-S6 e cercheremo di determinare come lo spostamento del segmento S4 si trasmetta ad S5 e S6. - analizzeremo in dettaglio i residui nel poro per cercare di determinare possibili cambiamenti conformazionali nel poro stesso durante il gating. La prima serie di esperimenti e' motivata dall' osservazione che il segmento S4 sembra muoversi nei canali HCN come negli usuali canali al K ( Mannikko et al 2002). Di conseguenza è molto importante determinare come sia necessaria una depolarizzazione per aprire i canali al K, al contrario dei canali HCN dove e' necessaria una iperpolarizzazione. La seconda serie di esperimenti e' motivata dall'osservazione che il poro nei canali al K non ha significativi cambiamenti conformazioni durante il gating, mentre nei canali al CNG, cugini sia dei canali HCN che di quelli al K, il poro stesso si apre e si chiude durante il gating. Dall'osservazione dei diversi effetti dei vari reagenti tra lo stato aperto e chiuso, sarà possibile ottenere stime dei cambiamenti conformazionali che avvengono durante l'apertura del canale. 2 - selettivita' del dominio di legame per i nucleotidi ciclici Poiche' e' adesso disponibile la struttura del dominio di legame per I nucleotidi ciclici del canale HCN2 intendiamo analizzare quantitativamente la natura molecolare della marcata selettività dei canali HCN per il cAMP. Risultati non pubblicati ottwenuti nel nostro laboratorio da Paola Roncaglia e da Pavel Mistrik hanno mostrato che i canali HCN ed in particolare i canali SpHCN sono attivati da concentrazioni micromolari di cAMP, mentre 1 mM di cGMP e' quasi completamente inefficace. Di conseguenza ci proponiamo di chiarire le basi molecolari di questa importante osservazione funzionale medinate simulazioni di dinamica con la struttura 3D del dominio di legame recentemente ottenuta ( Zagotta et al 2003 ) in presenza di cAMP e di cGMP. Questa analisi computazionale verra' svolta in collaborazione con il Prof Paolo Carloni della SISSA esperto in questa materia. Le conclusioni di questo lavoro teorico verranno verificate con esperimenti elettrofisologici con canali selvaggi e con canali in cui alcuni residui importanti verranno mutati per ottenere una conferma sperimentale del modello sviluppato. 3– modellizzazione del canale HCN In collaborazione con l'UdR di Milano, e Paolo Carloni alla SISSA svilupperemo un modello molecolare dettagliato della struttura tridimensionale dei canali HCN. Questi modelli verranno costruiti principalmente mediante la metodologia di omologia con strutture note. Studieremo in modo particolare i canali SpHCN ed I canali mHCN2, poiché il poro di tali canali è stato ampiamente studiato sperimentalmente (Roncaglia et al., 2002; Xue et al., 2002;Azene et al., 2003). Il nostro obbiettivo è di capire ed analizzare le differenze tra I canali HCN ed I loro cugini K e CNG, in modo tale da poter capire appieno l'origine delle loro differenze funzionali. La struttura 3D di diversi canali al K e' stata ottenuta dalla diffrazione ai raggi X, mentre questo fino ad adesso non e' stato possibile per i canali HCN, se non per il dominio citoplasmatico. Nello studio dei canali HCN esploreremo un ampio spettro di possibili conformazioni, cercando di analizzare quantita' fisiche che non dipendono criticamente dalla esatta struttura tridimensionale, ma che siano in grado di catturare le proprieta' essenziali dei canali e di evidenziare le differenze tra i canali al K, HCN e CNG. Il nostro approccio di modellizzazione si basera' – ovviamente – su diverse assunzioni, tutte suggerite da esperimenti: si assumera' che la struttura interna del poro dei canali HCN sia omologa a quella dei canali al K e che il motivo GYG formi il filtro del canale stesso come nei canali al K (Roncaglia et al., 2002). Di conseguenza il modello per la struttura del canale nello stato chiuso sarà quella del canale al K+ KcsA e del canale K+ KirBac1.1 (Zhou et al., 2001;Kuo et al., 2003). Assumeremo anche che l' orientamento dei domini S5 ed S6 siano simili alle eliche TM1 e TM2 del canale KcsA e che nello stato aperto l' elica S6 si pieghi, come nel canale MthK (Jiang et al., 2002a), come suggerito da esperimenti di elettrofisiologia (Shin et al., 2001;Rothberg et al., 2002; Rothberg et al 2003 ). La struttura dei modelli usati sono mostrati nella figura qui riportata: nel pannello A sono mostrate le strutture del dominio S6 del canale KcsA ( in blu ) e del canale MthK ( in rosso ). Queste strutture saranno confrontate con i dati ottenuti dagli esperimenti di elettrofisiologia descritti nella sezione 1 qui di sopra. L'analisi del blocco del Cd in canali mutati suggerisce appropriate distanze tra i residui omologhi delle eliche S6 delle diverse sottounita'. Queste indicazioni sperimentali verranno usate per modificare in modo appropriato i modelli originali, ovvero I templates, come mostrato nel pannello B della figura qui sopra. Di conseguenza il nostro obbiettivo e' la costruzione di modelli basati sulla omologia, ma che siano anche compatibili con gli esperimenti ottenuti nel presente progetto e riportati anche da altri studiosi nella letteratura. Per l'analisi dei meccanismi di gating useremo l'approccio della MSMD (multiple steering classical molecular dynamics) recentemente sviluppato (Jarzynski 1997). Questa nuova tecnica permette la ricostruzione del profilo di energia libera di qualsiasi trasformazione generale in una definita coordinata di reazione ed è stato già applicato con successo a simulazioni di dinamica molecolare classiche per diversi tipi di sistemi (e.g. Cascella et al 2002, Jensen et al 2002). Le predizioni complessive del lavoro computazionale e della modellizzazione del gating saranno confermate tramite esperimenti di mutagenesi direzionata che verrano effettuati dalla SISSA e dalla UdR di Milano. 4- biologia strutturale Come gia' detto nel modello A, si cerchera' anche di ottenere informazioni strutturali dirette sui canali HCN e sui canali CNG a loro simili ed in parte omologhi. Il lavoro in biologia strutturale è altamente complesso ed il suo successo non e' mai garantito. Di conseguenza le attività di biologia strutturale che si stanno intraprendendo sono complementari – e non essenziali - al presente progetto. Di conseguenza questa parte del progetto viene presentata nella piena consapevolezza dell' alto rischio coinvolto e della possbilita' di essere preceduti da altri gruppi. In collaborazione con ELETTRA, l'UdR della SISSA (Trieste) procedera' alla clonazione, overespressione e purificazione di diversi costrutti del dominio C-terminale di legame per i nucleotidi ciclici prevalentemente dei canali CNG. Ci si concentrera' sul costrutto del dominio di legame dei nucleotidi ciclici (CNB) - il minimo polipeptide necessario per il legame con GMP ciclico e AMP ciclico, e sul costrutto, d'ora in poi chiamato dominio C-terminale, che comprende la sequenza di collegamento localizzata a monte rispetto al CNB – il cosidetto C-linker. I costrutti verranno espressi in fusione a diverse appendici o "tag" (6His, proteina che lega il maltosio, glutatione S transferasi, GFP) allo scopo di aumentare la solubilita' del campione. Le sequenze di "tag" verranno successivamente rimosse dalla proteina di fusione mediante fattore XA, o proteasi TEV. Tecniche di cromatografia a scambio ionico, ad affinita' o ad esclusione, verranno impiegate per ottenere campioni ad alta purezza richiesta per gli studi strutturali. La correttezza dei costrutti verrà valutata mediante proteolisi limitata e successiva determinazione della sequenza N-terminale e del peso molecolare dei domini proteoliticamente stabili. Il contenuto della struttura secondaria e lo stato di oligomerizzazione del campione proteico, così come la formazione del complesso con il GMP ciclico e AMP ciclico, verranno studiati mediante una serie di tecniche biofisiche quali dicroismo circolare (CD), dispersione dinamica della luce (DLS), risonanza magnetica (NMR) e dispersione a raggi X a piccolo angolo. Verra' valutato il legame dei costrutti al GMP ciclico e AMP ciclico mediante utizzo di nucleotidi ciclici marcati radioattivamente. Esperimenti di prova dell'espressione in cellule procarioiche ospiti (E.coli), successiva purificazione per cromatografia di affinità, scambio ionico ed esclusione sono già stati effettuati con risultati piu' che incoraggianti. I risultati ottenuti fino ad adesso mostrano che la proteina che comprende i domini CNB e C-linker della subunità CNG1 del canale CNG dei bastoncelli bovini, overespressa e purificata, lega il GMP ciclico con un'affinità micromolare come mostrato dai saggi di rimozione dei GMP ciclico marcato radioattivamente da parte del GMP ciclico freddo. Verranno raccolti dati di diffrazione ai raggi X al raggio di cristallografia macromolecolare XRD1. Ci si aspetta che l'alta intensita' del raggio di fotoni di questo sincrotrone di terza generazione dia origine a dati di diffrazione di alta qualita' e risoluzione, necessari per una risoluzione affidabile della struttura, rifinizione e analisi della struttura/funzione. La soluzione del problema della fase verrà affrontato attraverso una combinazione di tecniche di sostituzioni molecolari (Molecolar replacement MR) e, se necessario, di dispersione anomala multi lunghezza d'onda (MAD). Il modello tridimensionale verrà rifinito e analizzato utilizzando programmi disponibili utilizzati correntemente in biologia strutturale moderna. La determinazione del dominio di legame dei nucleotidi ciclici nel canale CNG1 permetterà un confronto altamente utile con l'analogo dominio del canale HCN2 gia risolto ( Zagotta et al 2003 ) e permetterà di capire meglio l' origine molecolare delle differenze funzionali tra I canali HCN e CNG, per molti aspetti omologhi.