RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

CANALI IONICI ATTIVATI DALL'IPERPOLARIZZAZIONE DEL POTENZIALE E REGOLATI DA NUCLEOTIDI CICLICI(CANALI HCN).

Università di riferimento

Libera Università "Vita Salute S.Raffaele" MILANO - MEDICINA E CHIRURGIA - MILANO(MI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Antonio MALGAROLI

Descrizione

Lo scopo complessivo del nostro progetto e' quello di acquisire una migliore comprensione del ruolo funzionale dei canali HCN in vari tipi di cellule neuronali. Le attivita' descritte in questa parte del progetto (Udr Milano) nascono dall'attivita' integrata di due gruppi di ricerca diretti da Antonio Malgaroli (Universita' San Raffaele, Milano) e Dario DiFrancesco (Universita' degli Studi di Milano) che collaborano da molti anni su questi argomenti di ricerca. I canali HCN non sono solo espressi nel tessuto cardiaco ma anche in molte aree cerebrali ed in particolare a livello di molte sinapsi. Il progetto nasce dalla considerazione che ancora oggi si sa troppo poco sul meccanismo di funzionamento, sull'inserimento in membrana e sulla modulazione dell'attivita' di questa importante famiglia di canali ionici. Inoltre l'abbondanza del canale in compartimenti neuronali specifici quali le sinapsi suggerisce che il ruolo di questi canali possa non essere solo legato al controllo del livello del potenziale di membrana e dell'attivita' ritmica. All'interno di questo progetto le nostre linee di ricerca saranno le seguenti: 1. Studio della localizzazione cellulare e subcellulare Localizzeremo i canali HCN(1,2, 3 e 4) nei vari tessuti cerebrali, nell'epitelio olfattivo e nella retina. Come si puo' vedere dalla figura 1, abbiamo di recente sviluppato nel nostro laboratorio una batteria di anticorpi specifici per ognuna delle 4 isoforme HCN. Questi anticorpi isoforma-specifici vengono utilizzati per localizzare le varie isoforme grazie a tecniche di immunofluorescenza e di imaging confocale a 1- e 2-fotoni (con anticorpi primari e /o secondari fluorescenti). Dai risultati preliminari si e' evidenziata una colorazione differenziale delle varie aree cerebrali per le 4 isoforme di canale con particolare arricchimento in alcuni compartimenti cellulari quali dendriti e sinapsi (per esempio nella figura viene evidenziata la basket synapse nel cervelletto colorata con HCN1). Nel presente progetto particolare attenzione verrà indirizzata alla correlazione tra espressione e fenotipi neuronali specifici (i.e. cellule gabaergiche, glutammategiche, glicinergiche, colinergiche, etc) e all'analisi di specifici compartimenti quali i dendriti, gli assoni, e le sinapsi. Questi studi verranno poi estesi ad una localizzazione piu' fine che verra' eseguita per mezzo della microscopia elettronica usando la tecnica della marcatura con particelle d'oro. Guarderemo attentamente alla presenza dei canali HCN in specifici compartimenti endosomiali e di membrana nelle varie regioni neuronali (dendriti, assoni e sinapsi). In quest'ottica oltre all'analisi dei canali nativi studieremo la localizzazione subcellulare dei canali ricombinanti HCN4 espressi in cellule HEK293. Attraverso separazione su gradienti di saccarosio e analisi per western blot, abbiamo dimostrato che i canali sono localizzati nei lipid rafts, compartimenti di membrana particolarmente ricchi di sfingolipidi e colesterolo. Con metodiche elettrofisiologiche abbiamo anche visto che questa distribuzione influenza la curva di attivazione e le cinetiche di attivazione e deattivazione (Barbuti et al., 2004). Questo aspetto verra' analizzato in dettaglio nel corso di questo progetto non solo per i canali HCN ricombinanti ma anche per i canali nativi. In questa fase collaboreremo attivamente con l'UdR Pisa e UdR di SISSA-Menini per l'analisi della distribuzione del canale nella retina e nel sistema olfattivo. 2. Ricerca di nuovi interattori proteici e studio delle dinamiche di interazione. Negli ultimi anni è stato dimostrato che proteine con funzioni complementari formano complessi macromolecolari che favoriscono la funzionalità del sistema integrato (Putrella et al., 2000; Eldstrom et al., 2002). Indagini condotte nel nostro laboratorio con le tecniche del doppio ibrido e della coimmunoprecipitazione, hanno messo in luce l' interazione diretta tra HCN1 e Filamin A, una proteina citoscheletrica coinvolta nella formazione di complessi macromolecolari (Gravante et al., 2004). Intendiamo condurre uno screening della libreria di cervello di topo, già usata per lo screening con HCN1, con un'esca costituita dal C-terminale di HCN4, al fine di individuare gli interattori molecolari di questa isoforma e il loro ruolo nella modulazione del canale HCN4. In parallelo con questa analisi applicheremo un approccio proteomico con immunoisolamento dei canali con anticorpi subunita' specifici dalle sinapsi di vari distretti tissutali. Le miscele proteiche isolate (sinaptosomi) verranno separate grazie alla elettroforesi bidimensionale (2D) e gli spot proteici piu' interessanti microsequenziati (vedi figura 2: lavoro in collaborazione con la facility interna al San Raffaele Milano diretta da A. Bachi). Per questo studio useremo uno spettrometro di massa (MS) Maldi Tof e uno spettrometro di massa ibrido TOF dotato di una sorgente nanoelectrospray. Dopo aver identificato con certezza gl interattori proteici vedremo se nei vari tessuti e nelle varie condizioni fisiologiche (eg in presenza di stimoli quali quelli che aumentano il cAMP) il livello di questi interattori e/o il loro stato biochimico vengano ad essere modificati. Per esempio uno spostamento nel loro peso apparente, del punto isoelettrico verranno ad indicare modifiche post-traduzionali degli stessi quali fosforilazioni, glicosilazioni, degradazione proteolitiche. Queste modifiche post-traduzionale (PTM) verranno poi considerate per una 'ulteriore analisi e verranno correlate a possibili cambiamenti funzionali del tessuto nervoso quali quelli che avvengono alle sinapsi. Un metodo sperimentale che verra' usato per approfondire questa analisi delle PTM sara' quello del tagging isotopico (con atomi di deuterio) che migliorera' la quantificazione esatta delle proteine differenzialmente espresse (ICAT). Quando la vera natura di questi complessi sinaptici formati dai canali e interattori saranno note, potremo passare alla fase di analisi funzionale per cercare di capire come e dove avvengano queste interazioni e la loro rilevanza funzionale. Le tecniche che verranno usate in qesta fase comprenderanno le tecniche di FLIM e FCS (vedi sotto), ma anche tecniche di elettrofisiologia nei vari tessuti. Questa ricerca di interattori richiedera' una forte integrazione delle attivita' tra le UdR di SISSA-Menini e UdR di Pisa. 3. Analisi della struttura-funzione dei canali HCN Per lo studio della composizione in subunita' svilupperemo una serie di costrutti HCN dove le varie subunita' siano fuse a formare dei tetrameri con composizioni sia omotetrameriche che eterotetrameriche. In quest'ottica svilupperemo anche dei prodotti di fusione delle varie subunita' con proteine fluorescenti della famiglia GFP per studi di FRET e FLIM (vedi sotto) nell'ottica di visualizzare interazioni dirette tra queste subunita' e stabilire le stechiometrie relative nei vari compartimenti cellulari e subcellulari. Nel momento in cui saranno disponibili gli interattori specifici se ne studiera' l'effetto sul funzionamento delle varie isoforme. Uno degli aspetti di modulazione che intendiamo studiare e' relativo al movimento del sensore del voltaggio S4 che è accoppiato all' apertura del canale nei canali HCN. I canali HCN appartengono alla superfamiglia dei canali attivati da nucleotidi ciclici (CNGC) e canali di potassio voltaggio dipendenti, dai quali si differenziano in quanto sono attivati in iperpolarizzazione. Le basi molecolari di questa voltaggio dipendenza invertita rispetto a quella di tutti gli altri canali di potassio non sono note. Per indagare questo specifico aspetto del funzionamento dei canali HCN, intendiamo costruire con la tecnica della PCR-overlap una serie di chimere tra l' isoforma HCN1 e il canale attivato in depolarizzazione M-EAG, che tra i canali attivati in depolarizzazione presenta la maggiore omologia di sequenza con HCN. Per semplificare il sistema uilizzeremo una forma tronca al C-terminale di HCN1, in modo da eliminare la modulazione da cAMP tipica degli HCN, lasciando intatta la voltaggio dipendenza (Weinger et al., 2001). Quindi scambieremo il poro di HCN1 con quello di EAG, aggiungendo in seguito il linker S4S5 e il sensore del voltaggio S4, cioè le porzioni che secondo i dati presenti in letteratura sembrano essere coinvolte nel gating dei canali (Chen et al., 2001; Chen et al., 2000). I canali nativi e chimerici saranno espressi in oociti di Xenopus e le correnti misurate col voltage clamp a due elettrodi. Una GFP verrà attaccata al terminale amminico dei canali per verificare la fluorescenza di membrana con microscopia confocale. In una seconda fase intendiamo costruire altre chimere scambiando porzioni più ristrette tra HCN ed EAG, scambiando solo il linker S4S5 e il dominio transmembrana S4. Modelli per la comprensione del comportamento dei canali chimerici verranno elaborati in collaborazione con l'UdR di SISSA-Torre. . 4. Analisi dei processsi di targetting in membrana e di turnover La mancanza di ligandi irreversibili per recettori ed canali di interesse in questo progetto, comporta la pianificazione di nuove strategie per potere ottenere utili informazioni circa l'internalizzazione, la degradazione e la velocità di inserzione (turnover) dei canali in membrana. Queste strategie verranno basate su costrutti di fluorescenti dei canali e su anticorpi già disponibili o in preparazione (anti epitopi extracellulari) nei nostri laboratori. In quest'ottica svilupperemo prodotti di fusione tra le varie isoforme HCN e proteine fluorescenti della famiglia GFP che verranno poi espresse ed analizzate in vivo con tecniche di microscopia confocale a 1 o 2 fotoni. Questi costrutti saranno espressi o direttamente nelle cellule HEK o grazie allo sviluppo di vettori virali della famiglia Semliky Forest (SFV) che vengono prodotti nei nostri laboratori e che hanno dimostrato un'ottima efficacia di espressione in cellule neuronali grazie al loro neurotropismo (Lundstrom et al. 2003). Grazie allo sviluppo di queste proteine di fusione e di costrutti omologhi per i loro interattori proteici saremo in grado di analizzare in dettaglio la distribuzione in membrana di questi canali e dei loro interattori e la permanenza nei compartimenti di riserva che li ospitano. Il piano iniziale è quello di studiare il trafficking intracellulare ed il turnover dei canali HCN1-2-3 e 4 e l'effetto su questi parametri dei vari interattori trovati. Brevemente, potremo accumulare dati cinetici con tecniche di imaging sui linee cellulari e neuroni che esprimano i canali fluorescenti o tramite anticorpi anti epitopi extracellulari/tecniche di biotinilazione e western blot quantitativo. Queste strategie sono attualmente in uso nei nostri laboratori e sono già stati ottenuti dati preliminari circa la visualizzazione dei canali inseriti in membrana, la loro emivita, e la velocità di riciclo per alcune di queste proteine. La combinazione di immunotags in tandem permetterà l' analisi contemporanea del trafficking intracellulare di più canali o proteine interagenti, ma anche di seguire il trafficking degli stessi canali durante periodi di tempo successivi. Per questi esperimenti useremo tecniche di ottica basate su segnali proteici fluorecenti a lunghezze d' onda multiple. Per poter studiare questi aspetti impiegheremo la tecnica di microscopia confocale a singolo-doppio fotone. Dalla determinazione della fluorescenza proveniente da un piccolo volume, è possibile studiando le fluttuazione di fluorescenza prodotte da un piccolo numero di molecole proteiche, definire la mobilità delle proteine (entrata o uscita dal punto illuminato: Fluorescence Correlation Spettroscopy o FCS), la velocità di legame e le energie di attivazione. In presenza di coppie di proteine fuorescenti che interagiscono, la natura, l'entita' e le dinamiche di queste interazioni proteina-proteina possono essere studiate in dettaglio analizzando sia le variazioni di emivita' della fluorescenza (Fluorescence lifetime imaging o FLIM) o piu' semplicemente con la tecnica FRET. Queste misure saranno realizzate con un laser pulsato negli infrarossi (Tsunami 3960, Spectra Physics Inc., CA), pompato da un laser a semi conduttori ad alta potenza (Millennia V, Spectra Physics Inc., CA). Il sistema sarà dotato di un modulo Lock-in e dal punto di vista della testata confocale, si basera' su di una testata commerciale (Zeiss). Con queste tecniche analizzeremo la localizzazione, la diffusione in membrana, il trafficking, ed il turnover delle varie isoforme sia wild type che mutate grazie alla rimozione o all'inserimento di particolari domini proteici nella sequenza dei canali HCN. Un obiettivo particolare di questo parte del lavoro consistera' nell' analizzare la modulazione dell'inserimento in membrana e del turnover dei canali HCN. Visto che i canali sembrano essere arricchiti nei lipid rafts intendiamo anche studiare l' effetto della modulazione b-adrenergica, dato che è noto che i recettori b2 adrenergici e l' adenilato ciclasi sono localizzate nelle caveole. In questo contesto analizzeremo l'effetto del cAMP, del calcio, dell'attivazione di chinasi e fosfatasi in modo da rivelare cambiamenti macroscopici nella distribuzione dei canali o cambiamenti più fini nelle cinetiche. Questo parte dello studio verra' svolta in stretta collaborazione l'UdR di SISSA-Menini per quanto riguarda le proprietà' dei neuroni olfattivi e con UdR di Pisa per il targetting nei fotorecettori e con l'UdR di SISSA- Torre per i modelli interpretativi delle interazioni trovate. 5. Studio del ruolo di questi canali sull'attivita' sinaptica. L'obbiettivo e' di analizzare il ruolo sinaptico del canale sia nell'ippocampo che nel cervelletto ma anche nei fotorecettori e nei neuroni olfattivi. In particolare ci focalizzeremo sulle sinapsi inibitorie nella regione ippocampale e sulle basket synapses nel cervelletto visto che dalle nostre analisi preliminari esse presentano grossi livelli di espressione di alcune isoforme dei canali HCN. Questo suggerisce che il ruolo di questi canali possa andare oltre il controllo del potenziale di membrana (Beaumont et al. 2000). Analoghi esperimenti verranno condotti in collaborazione con l'UdR di SISSA-Menini e UdR di Pisa. Analizzeremo le proprieta' delle correnti spontanee ed evocate in condizioni in cui i canali nativi siano in grado di contribuire attivamente oppure siano stati bloccati. I risultati potrebbero fornire importanti informazioni su modifiche dei parametri statistici alla base della trasmissione sinaptica. In particolare l'analisi delle distribuzioni delle ampiezze e della variabilita' delle risposte evocate e spontanee dovrebbe chiarire se il canale puo' in qualche modo modificare la probabilita' di rilascio delle vescicole sinaptiche (i canali HCN potrebbero essere inglobati nei siti di rilascio) o influire sulle varie forme di facilitazione sinaptica. In questa fase oltre alle tecniche di elettrofisologia avanzata (Abenavoli et al. 2002) useremo metodi ottici per visualizzare direttamente il ciclo di esocitosi-endocitosi delle vescicole sinaptiche grazie all'uso di molecole fluorescenti (Malgaroli et al. 1995). Recentemente e' stato dimostrato che i canali HCN sono in grado di permeare ioni calcio (Yu et al. 2004). La loro apertura determina quindi aumenti della concentrazione di calcio nel citosol. Sara' importante analizzare se questi aumenti di calcio si verificano anche alle sinapsi e siano in grado di portare ad una facilitazione della trasmissione sinaptica. Un'altro aspetto importante di questa ricerca riguardera' l'analisi degli effetti funzionali degli interattori sinaptici trovati. Sulla base dei risultati cominceremo a selezionare per gli interattori piu' interessanti tra quelli trovati e aumentandone o eliminandone (RNAi) l'espressione cercheremo di evidenziare possibili ruoli funzionali alle sinapsi.