RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

CANALI IONICI ATTIVATI DALL'IPERPOLARIZZAZIONE DEL POTENZIALE E REGOLATI DA NUCLEOTIDI CICLICI(CANALI HCN).

Università di riferimento

Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati di TRIESTE - SETTORE BIOFISICA - GRIGNANO(TS)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Anna Maria MENINI

Descrizione

L'Unità di Ricerca SISSA-Menini studierà le proprietà funzionali dei canali HCN nei sistemi olfattivi dei mammiferi. Questa ricerca contribuirà alla comprensione del ruolo funzionale del canale HCN nell'elaborazione dell'informazione olfattiva. La presenza delle correnti Ih nei neuroni olfattivi sia nel sistema olfattivo principale che in quello accessorio è nota, anche se il loro ruolo funzionale è attualmente poco chiaro. LE MANSIONI SPECIFICHE DI QUESTA UNITÀ SONO: 1) l'identificazione delle isoforme del canale HCN espresse nei neuroni sensoriali olfattivi e vomeronasali del topo 2) la caratterizzazione delle proprietà funzionali dei canali HCN nei neuroni sensoriali olfattivi e vomeronasali del topo 3) la caratterizzazione delle proprietà funzionali dei canali HCN nei neuroni del bulbo olfattivo principale e accessorio. 4) Lo studio del ruolo fisiologico dei canali HCN nel comportamento oscillatorio del bulbo olfattivo. La nostra Unità di Ricerca ha una vasta esperienza di registrazioni elettrofisiologiche da neuroni olfattivi e di correnti generatiedai canali ionici attvati dai nucleotidi ciclici (CNG). La combinazione di queste esperienze pone questa unita' in posizione privilegiata per affrontare lo studio delle proprietà funzionali e del ruolo fisiologico degli HCN nei sistemi olfattivi. Useremo le seguenti tecniche: - registrazioni elettrofisiologiche in patch-clamp da neuroni sensoriali olfattivi e vomeronasali isolati - immuno-citochimica per identificare le diverse isoforme dei canali HCN nei neuroni sensoriali (in collaborazione con le unità di Pisa e Milano) - registrazioni elettrofisiologiche in patch-clamp da neuroni di topo in fettine acute di bulbo olfattivo principale e accessorio I CANALI HCN NEI NEURONI SENSORIALI DELL'EPITELIO OLFATTIVO E VOMERONASALE Studieremo la composizione delle isoforme e le caratteristiche funzionali dei canali HCN nei neuroni sensoriali del topo nell'epitelio olfattivo e vomeronasale. La composizione delle isoforme dell' HCN nei neuroni sensoriali olfattivi non è ancora stata studiata, percio' faremo degli studi immunocitochimici su questi neuroni per studiare e localizzare il tipo di isoforme espresse. Abbiamo effettuato alcuni esperimenti immuno-citochimici preliminari per studiare l'espressione dell' isoforma HCN1 nei neuroni sensoriali olfattivi e vomeronasali del topo. La Fig.2 mostra dati preliminari che indicano che l'isoforma HCN1 e' presente sia nei neuroni olfattivi che vomeronasali. Ulteriori esperimenti di immunocitochimica, per localizzare e co-localizzare le varie isoforme e la loro distribuzione subcellulare, verranno effettuati in collaborazione con le unità di Pisa e Milano, quest'ultima fornira' anticorpi per tutti e quattro le isoforme dei canali HCN. Inoltre studieremo elettrofisiologicamente le proprietà funzionali delle correnti Ih nei neuroni sensoriali olfattivi e vomeronasali isolati del topo con la tecnica del patch clamp in configurazione whole-cell e perforated-patch. Studieremo la cinetica di attivazione della corrente e la sensibilità al cAMP e alla temperatura delle correnti Ih in entrambi i tipi neuronali e ci aspettiamo di trovare alcune differenze. Infatti, il cAMP è il trasmettitore interno nei neuroni sensoriali dell'epitelio olfattivo principale, mentre non sembra essere coinvolto nella trasduzione del segnale nei neuroni vomeronasali. Quindi, nei neuroni olfattivi, e' possibile che l'aumento fisiologico di cAMP possa avere un effetto sui canali HCN. Anche se la trasduzione del segnale è compartimentalizzata nella zona apicale, le ciglia, i canali HCN potrebbero essere presenti in zone sub-cellulari accessibili al cAMP. Per studiare in dettaglio la modulazione dei canali HCN da parte del cAMP, sfrutteremo la fotolisi del caged-cAMP che produce un aumento di concentrazione istantaneo e localizzato del nucleotide ciclico. La nostra unità utilizza spesso la tecnica di fotolisi di composti chimici nei neuroni sensoriali olfattivi (Lagostena e Menini, 2003). I risultati ottenuti con i canali nativi saranno confrontati con le proprieta' delle correnti generate dalle diverse isoforme del canale HCN in sistemi di espressione eterologa e con i risultati degli esperimenti di immunocitochimica. Nel caso in cui la subunita' HCN2 risultasse espressa nei neuroni olfattivi e vomeronasali, effettueremo esperimenti di elettrofisiologia nei neuroni sensoriali di topi AP4/AP4, forniti dalla unità di Milano. In questi topi il canale HCN2 e' privo del dominio che lega il nucleotide ciclico. Inoltre studieremo il ruolo fisiologico di questi canali nella determinazione delle proprietà a riposo della cellula o nella modulazione della sua eccitabilita'. Una volta dissociati, i neuroni sensoriali olfattivi sono in grado di generare solo pochi potenziali d'azione e quindi non è possibile utilizzarli per studiare le proprieta' attive della cellula. A questo scopo utilizzeremo fettine acute di epitelio olfattivo o vomeronasale di topo per determinare il ruolo funzionale delle correnti Ih. Fig. 2 Microfotografia di neuroni sensoriali olfattivi isolati di topo: il pannello a sinistra mostra i neuroni olfattivi e quello centrale la positivita' per l'anti-HCN1 (Alomone Lab., Israele) (rosso); il pannello di destra mostra la marcatura dei nuclei (blu). Scala 10 micron. Fig. 3 Microfotografia di un neurone vomeronasale isolato di topo: il pannello a destra mostra positivita' per l'anti-HCN1 (Alomone Lab., Israele) (rosso). Scala 10 micron. BULBO OLFATTIVO Come discusso nella parte 2.4, le correnti di Ih nel bulbo olfattivo non sono state caratterizzate sistematicamente, anche se sporadici studi elettrofisiologici (Cadetti e Belluzzi, 2001; Pinato e Midtgaard, 2003), di ibridazione in-situ e di localizzazione immunoistochimica, (Monteggia ed altri, 2000; Santoro ed altri, 2000; Holderith ed altri, 2001; Notomi e Shigemoto, 2004) indicano che questi correnti sono presenti in diverse popolazioni di cellule nel bulbo. REGISTRAZIONI ELETTROFISIOLOGICHE IN FETTINE DI BULBO OLFATTIVO DI TOPO Recentemente, abbiamo sviluppato nel nostro laboratorio la tecnica di preparazione di fettine di bulbo olfattivo di topo. Le fettine di 350 micrometri di spessore vengono preparate usando un vibratomo. La Fig. 4 mostra una sezione coronale del bulbo olfattivo di topo e la sua tipica struttura laminare. Gli strati identificati sono indicati. Fig. 4 Sezione coronale del bulbo olfattivo di topo con l'indicazione dei vari strati: ONL: strato del nervo olfattivo, GL: strato glomerulare, EPL: strato esterno plessiforme, MCL: strato delle cellule mitral, IPL: strato interno plessiforme, GCL: strato delle cellule granulari. Abbiamo inoltre gia' messo a punto nel nostro laboratorio l'apparecchiatura e la tecnica per effettuare registrazioni elettrofisiologiche da fettina con la tecnica del patch-clamp. La fig. 5 mostra un elettrodo da patch applicato su una cellula mitrale. L'identificazione delle cellule da cui vengono effettuate le registrazioni e' fatta in base alle caratteristiche morfologiche ed elettrofisiologiche. L'analisi morfologica verra' effettuata anche inserendo nelle cellule, tramite la pipetta da patch, marcatori fluorescenti (Lucyfer Yellow) e fissando il tessuto dopo aver effettuato le misure elettrofisiologiche. Fig. 5 Elettrodo da patch applicato al soma di una cellula mitrale situata nello strato MCL. La cellula è caratterizzata da un ampio dendrite apicale che si dirige dal soma verso lo strato glomerulare. Abbiamo gia' ottenuto alcuni esperimenti preliminari in fettine del bulbo olfattivo di topo, che indicano la presenza di correnti Ih in diversi tipi di neuroni olfattivi. La caratterizzazione funzionale sarà effettuata con la tecnica del pach clamp sia in current che voltage-clamp. Poiche' l'attivazione della corrente Ih dipende dalla temperatura, le registrazioni verranno effettuate anche a temperatura fisiologica. Le figure 6 e 7 illustrano i risultati dei nostri esperimenti preliminari in cellule dello strato glomerulare (Fig. 6) e mitrali (Fig. 7): in entrambi i tipi di cellule abbiamo registrato la presenza di una rettificazione anomala con cinetica e ampiezza variabile. Nei nostri esperimenti preliminari le cellule non sono state trattate con antagonisti della trasmissione sinaptica, e quindi nelle registrazioni e' presente un'attivita' sinaptica di fondo, caratterizzata da potenziali d'azione spontanei (confrontare Figs. 6a e 7, con la Fig. 1, nella Descrizione scientifica di base 2.4 , dove sia le sinapsi eccitatorie che inibitorie sono state bloccate con SR95531, CNQX e AP-5). Le registrazioni in current-clamp in Fig. 6a sono state ottenute da un neurone dello strato glomerulare. Stimoli iperpolarizzanti inducono l'attivazione di un pronunciato "sag" nella risposta del potenziale, tipico effetto delle correnti attivate dalla iperpolarizzazione, sia di tipo Ih che Ikir (Pape, 1996). La registrazione da una diversa cellula sempre nello strato glomerulare (Fig. 6b), non mostra la stessa rettificazione della cellula in Fig. 6a, indicando che i neuroni dello strato glomerulare hanno varie distribuzioni dei canali HCN. Fig. 6 (a) Registrazioni di potenziale (current clamp) da una cellula dello strato glomerulare del topo. La cellula mostra una rettificazione in risposta a gradini di corrente iperpolarizzanti (pulsi di ampiezza variabile da –15 a –65 pA, con incremento di -10 pA, a partire da una corrente stazionaria di –15 pA) Potenziale di mantenimento (holding potential): -75 mV. Notare i potenziali d'azione generati nella fase di ripolarizzazione che segue il gradino di corrente. (b) registrazioni di potenziale da una diversa cellula dello strato glomerulare. Questa cellula non mostra rettificazione in seguito ad una iperpolarizzazione (pulsi di ampiezza variabile da –5 a –25 pA, con incremento di -5 pA a partire da una corrente stazionaria di –25 pA). Potenziale di mantenimento: -65 mV (primo pannello). La stessa cellula per iperpolarizzazioni piu' lunghe (-12 pA da una corrente stazionaria di 0 pA). Potenziale di mantenimento: –60 mV. La Fig. 7a mostra correnti registrate da una cellula mitrale con una minima rettificazione anomala, sebbene la presenza di Cs+ aumenti la iperpolarizzazione della cellula (Fig. 7b). Effettueremo uno studio farmacologico dettagliato per separare le correnti Ikir da quelle Ih, bloccate rispettivamente da ZD7288 e Ba2+, in analogia a quanto mostrato nella Fig.1 nella parte 2.4. Fig. 7 Risposte di potenziale da una cellula mitrale di topo in risposta a gradini di corrente iperpolarizzanti (pulsi di ampiezza variabile da –6 a –56 pA, con incremento di -5 pA, a partire da una corrente stazionaria di –6 pA). Potenziale di mantenimento: -70 mV. Primo pannello: controllo. Secondo pannello: effetto di 2mM CsCl. Terzo pannello: recupero. Si noti l'attivita' sinaptica di fondo che contribuisce al potenziale di membrana con ampie fluttuazioni. Caratterizzeremo sistematicamente le proprietà elettrofisiologiche delle correnti Ih in tutte le principali popolazioni di neuroni olfattivi del bulbo, cioè nelle cellule periglomerulari, mitrali e tufted, granulari e short-axon. Questa caratterizzazione sistematica contribuirà a correlare le differenze nella cinetica e nell'ampiezza delle correnti registrate con il "firing pattern" del tipo di cellula. Infine aggiungerà informazioni importanti sul ruolo delle proprietà intrinseche dei neuroni nell'elaborazione dell'informazione all'interno del bulbo olfattivo. BULBO OLFATTIVO ACCESSORIO Per quanto ci e' noto, le correnti Ih dei neuroni del bulbo olfattivo accessorio non sono state ancora studiate. Tuttavia, recentemente (Notomi e Shigemoto, 2004; parte 2.4) è stato trovato un segnale molto intenso di immunoreattivita' per la isoforma HCN3 nello strato interno plessiforme, mentre un segnale molto piu' debole e' stato trovato anche per le altre isoforme. Come nel sistema olfattivo principale, faremo fettine di bulbo olfattivo accessorio di topo ed effettueremo esperimenti di patch-clamp per caratterizzare le proprieta' elettrofisiologiche della corrente Ih in tutte le principali popolazioni cellulari del bulbo olfattivo accessorio. Questi esperimenti forniranno nuove importanti informazioni sulle proprieta' elettrofisologiche del canale HCN3 che, data la sua rara espressione, non e' ancora stato ben caratterizzato fisiologicamente. Ulteriori esperimenti di immunoistochimica, nelle sezioni fissate di bulbo principale e accessorio, verranno effettuati in collaborazione con le unità di Pisa ed Milano.