RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

CANALI IONICI ATTIVATI DALL'IPERPOLARIZZAZIONE DEL POTENZIALE E REGOLATI DA NUCLEOTIDI CICLICI(CANALI HCN).

Università di riferimento

Università di PISA - PSICHIATRIA,NEUROBIOLOGIA, FARMACOLOGIA E BIOTECNOLOGIE - PISA(PI)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luigi CERVETTO

Descrizione

Nel quadro generale delle attività coordinate in questo progetto di ricerca il compito dell'UDR di Pisa è quello di ottenere informazioni dettagliate sulla distribuzione e proprietà dei canali HCN nella retina dei mammiferi. L'obiettivo a lungo termine di questo studio è stabilire il ruolo funzionale dei canali HCN nella elaborazione dell'informazione visiva. Studi precedenti svolti dal nostro gruppo hanno indicato che, sia i canali attivati dalla iperpolarizzazione della membrana (Ih), che quelli attivati dalla depolarizzazione della membrana (Ikx), sono localizzati nel segmento interno dei bastoncelli retinici. L'attivazione di questi canali induce risonanza nei fotorecettori, una condizione necessaria, per la realizzazione della fedeltà temporale dei segnali visivi (Armstrong-Gold and Rieke, 2003). Questa condizione, tuttavia, non è sufficiente a dar ragione delle prestazioni di acuità temporale del sistema visivo che presuppongono l'esistenza di ulteriori processi che integrano e/o modulano questa azione. Noi ipotizziamo che, nella retina, i canali HCN costituiscano una famiglia eterogenea per struttura e proprietà e che siano distribuiti su vari neuroni, e in modo particolare espressi sui dendriti delle cellule bipolari con la funzione di continuare ed eventualmente perfezionare l'elaborazione dei segnali visivi avviata dai fotorecettori (Bialek and Owen, 1990). Un importante corollario di questa ipotesi è che, sia nei bastoncelli che nelle cellule bipolari, la Ih interagisca con altre correnti con caratteristiche adeguate a realizzare un processo di amplificazione a banda passante dei segnali visivi. I COMPITI SPECIFICI DI QUESTA UNITA' SONO: 1) la caratterizzazione delle proprietà dei canali HCN espressi nelle cellule bipolari retiniche. 2) l' identificazione del ruolo dei canali HCN nella genesi di fenomeni di risonanza nei fotorecettori e nelle cellule bipolari. 3) l' identificazione di altre correnti le cui proprietà di attivazione diano luogo a fenomeni di risonanza amplificata. 4) la valutazione del contributo relativo dei canali pre-sinaptici e post-sinaptici nel determinare l'acuità temporale del sistema visivo. Queste indagini richiedono l'applicazione di metodologie sperimentali e analitiche diverse, molte delle quali fanno parte di un consolidato bagaglio tecnico-scientifico del nostro gruppo. Per alcune metodiche ricorreremo alla collaborazione con le altre unità impegnate in questo progetto. Gli esperimenti verranno condotti combinando diversi procedimenti quali: a) registrazioni con la tecnica del perforated-patch-clamp in voltage-clamp da neuroni in sezioni retiniche di topo, con l'obiettivo di caratterizzare la cinetica delle correnti e la loro modulazione da parte dell'cAMP. L'analisi di Fourier mediante FFT verrà effettuata su risposte ottenute da registrazioni con la tecnica del perforated-patch in current-clamp in risposta a correnti e stimoli di luce modulati sinusoidalmente nel tempo, con lo scopo di stabilire le proprietà di amplificazione a banda passante associate con l'attivazione dei canali; b) tecniche di microscopia confocale ad alta risoluzione e di immunoistochimica saranno applicate a sezioni fissate di retina per stabilire la mappa di distribuzione dei canali; c) risposte elettroretinografiche (ERG) a stimoli luminosi sinusoidali saranno registrate sia in topi normali che in topi portatori di una mutazione spontanea per il canale HCN2. FASI TEMPORALI DEL PROGETTO La ricerca sarà organizzata suddividendo le attività programmate in due fasi principali, FASE 1 e FASE 2 rispettivamente di 15 e 9 mesi. FASE 1: Saranno affrontati i punti seguenti: 1) la distribuzione dei canali HCN nella retina e la composizione delle subunità dei canali responsabili della Ih nelle cc. bipolari; 2) risonanza elettrica e amplificazione a banda passante nei bastoncelli retinici e nelle cc. bipolari 3) il contributo relativo dei canali pre- e post- sinaptici nella determinazione della acuità temporale visiva. I quesiti relativi alla distribuzione retinica dei canali HCN e alla composizione delle subunità dei canali dell'Ih nelle cc. bipolari verranno affrontati mediante indagini immunoistochimiche e registrazioni in patch-clamp da sezioni di retina. L'analisi Western blot con anticorpi commerciali (Alamone) su lisati retinici di topo suggeriscono che entrambe la isoforme HCN1 e HCN2 sono espresse nella retina. L'immunomarcatura di sezioni retiniche di topo indica la presenza di HCN1 nei bastoncelli e nell'IPL e di HCN2 nei dendriti di cellule bipolari bastoncellari e cellule bipolari di tipo "on", entrambe post-sinaptiche ai fotorecettori, e nell'IPL. Un esempio di questi risultati preliminari è riportato nella Fig.1, dove le aree di sovrapposizione degli HCN2 (marcati in rosso)e dell'anti PKC (C-rod bipolars) e dell'anti Go (D-on bipolars)(marcati in verde) appaiono marcate in giallo e pertanto suggeriscono una colocalizzazione. Partendo da questi risultati preliminari, gli esperimenti di immunoistochimica e di elettrofisiologia mireranno a correlare l'espressione delle varie isoforme con le proprietà dell'Ih espresse in neuroni retinici identificati. Altri dati preliminari (vedi: Fig. 2 e Fig. 4) indicano che nella maggior parte delle cc bipolari la Ih si attiva con una costante di tempo intermedia tra quella degli HCN1 e degli HCN2. Questo potrebbe significare che una stessa cellula è in grado di esprimere entrambe le isoforme. Dagli esperimenti di doppia marcatura ci aspettiamo di ottenere informazioni sulla possibile co-espressione di HCN1 e HCN2 in una sottoclasse di cc. bipolari coinvolte nella elaborazione dell'acuità visiva. Tutte queste analisi verranno effettuate sia nelle retine di animali normali (wt) che mutanti, omo-ed etero-zigoti (AP+/- e AP-/-). La risonanza elettrica e l'amplificazione a banda passante saranno esplorate mediante l'analisi di correnti ioniche, distinte dall' Ih, attivate nel regime di potenziale di membrana di rilevanza fisiologica per la cellula. Particolare attenzione verrà rivolta a quelle correnti che interagendo con le correnti responsabili della risonanza (Ih) realizzano un'amplificazione a banda passante. Possibili candidati per questa azione sono le correnti il cui potenziale di inversione si trova vicino al voltaggio di massima attivazione, a differenza dell'Ih il cui potenziale di inversione è più vicino al valore minimo della sua curva di attivazione. A questo scopo analizzeremo sia empiricamente (con la registrazione delle risposte a stimoli luminosi e di corrente modulati sinusoidalmente nel tempo), sia teoricamente (mediante simulazioni con modelli), il ruolo delle varie correnti ioniche implicate nei fenomeni di risonanza e amplificazione. Candidati possibili per la realizzazione di risonanze amplificate sono, oltre all'Ih, la Ikir, la ICl (quando il potenziale di equilibrio del Cl è vicino a 0. Vedansi a tal proposito le tail currents a -70 Fig. 2), la ICa, la corrente associata ai recettori NMDA (nelle bipolari). Il contributo dei canali HCN verrà valutato mediante l'uso di bloccanti selettivi. Attualmente è disponibile una gamma di bloccanti organici specifici per la Ih che, come abbiamo potuto verificare in via preliminare, non influenzano le altre correnti selettive per il potassio quali la Ikir e la Ikx,. L'analisi dei dati sarà poi effetuata anche in collaborazione con altre UDR impegnate nel progetto (Vedi COLLABORAZIONI). Effettueremo la correlazione tra dati elettrofisiologici e morfologici usando elettrodi riempiti con lucifer yellow(LY) che, alla fine dell'esperimento, dopo aver ottenuto una condizione di whole cell sarà iniettato nel sito di registrazione. Le risposte di fotorecettori e cellule bipolari a stimoli di corrente o di luce modulati sinusoidalmente nel tempo saranno registrate con la tecnica del perforated patch. L' impedenza della cellula verrà calcolata dal rapporto tra le ampiezze di risposta in voltaggio e in corrente della prima armonica ottenute mediante FFT. Per valutare la dipendenza dal voltaggio, l' impedenza verrà anche determinata a diversi potenziali di membrana. Inoltre dati raccolti dalle cellule bipolari verranno confrontati con le misure ERG (mediante le quali le risposte delle bipolari possono essere studiate in maniera non invasiva, vedi Gargini et al. 1999a). FASE 2 Studieremo il ruolo degli HCN2 nella modulazione della risoluzione temporale di trasmettitori retinici quali la dopamina. E' possibile che la modulazione della acuità temporale da parte della dopamina sia mediata da variazioni nel livello di AMPc che influenza i canali HCN2 delle cellule bipolari dei bastoncelli e di altre cellule bipolari ON. Per valutare il contributo della modulazione degli HCN2 in risposta a variazioni di AMPc generate dall' attivazione dei recettori D2 per la dopamina ci proponiamo di paragonare la risoluzione temporale della risposta alla luce in animali normali con quella di animali mutanti che difettano principalmente del CNBD del HCN2 (AP-/- e AP+/-forniti dall' UDR di Milano). L' ERG sarà misurato in animali normali e in mutanti prima e dopo iniezione intraperitoneale di agonisti e di antagonisti per la dopamina. Gli effetti di sostanze dopaminergiche verranno paragonati a quelli prodotti da iniezioni intramuscolari di bloccanti la Ih. Questi risultati veranno integrati da misure dirette da rod-bipolar in topi mutanti e dall' analisi di canali HCN2 mutanti, espressi in sistemi ricombinanti. Il lavoro sui canali mutanti verrà condotto in collaborazione con l'UDR di Milano che ha le necessarie conoscenze per generare il canale mutante e per caratterizzarne le proprietà funzionali usando l' espressione eterologa sia in oociti che in linee cellulari di mammifero quali CHO o/e HEK243. In esperimenti di controllo verificheremo mediante immunoistochimica e tecniche di blotting se la mutazione influenza numero e distribuzione subcellulare dei canali. POSSIBILI PROBLEMI: Abbiamo già raccolto, in via preliminare, risultati di esperimenti di Western-blot su lisati di retine di topo e di prove immunoistochimiche ottenute da sezioni retiniche di topi wt e AP+/- (vedi: Fig. 1 e Fig. 4). Riteniamo pertanto che questa parte del progetto non presenti ostacoli metodologici di rilievo. Una possibile difficoltà potrebbe sorgere nelle registrazioni ERG da mutanti omozigoti (AP-/-) che hanno sopravvivenza limitata e che normalmente non superano un mese di vita. Nel corso di test preliminari abbiamo verificato che misure ERG in topini di pochi giorni hanno un grado di successo piuttosto basso (circa 20%). La situazione migliora, tuttavia, quando si registra in animali di 20-30 giorni (vedi Fig. 3). Il problema dovrebbe essere comunque superabile utilizzando animali eterozigoti che hanno una aspettativa di vita più lunga degli omozigoti (I dati preliminari riportati in Fig. 4 mostrano che in questi ultimi la struttura della retina e la distribuzione degli HCN sono pressochè normali). Abbiamo già effettuato registrazioni da fettine di retina e l'unico problema riscontrato è che con sezioni di 150 m è difficile ottenere buone risposte alla luce da cellule bipolari. Abbiamo, tuttavia, motivo di ritenere che sia possibile migliorare la qualità delle risposte modificando la tecnica di preparazione in modo da avere un numero maggiore di cellule in buone condizioni funzionali. Qualora questa difficoltà dovesse persistere, utilizzeremo, l'iniezione di corrente per simulare le risposte visive, un procedimento che, ai fini dell'analisi delle proprietà elettriche, non limita i nostri obiettivi. Un problema potenzialmente più serio potrebbe presentarsi nell'analisi della costante di tempo di attivazione dell'Ih nelle cc. bipolari. Le determinazioni immunoistochimiche da noi condotte suggeriscono che gli HCN delle bipolari siano espressi prevalentemente nei dendriti, ad una certa distanza dal soma. Per questo motivo potrebbe risultare problematico ottenere un clamp uniforme della cellula. Bisogna tuttavia notare che i dendriti delle bipolari dei bastoncelli sono piuttosto corti, con una distanza tra soma e punta dell' ordine di 20-30 m, un valore molto inferiore alle centinaia di m osservati nei neuroni piramidali della corteccia e dell'ippocampo dove lo space-clamp rappresenta un problema. Può essere ragionevole sospettare che il rimbalzo della corrente di membrana che riportiamo nella Fig. 2 rifletta un problema di space-clamp. Un rimbalzo del tutto simile osservato nella corrente dei bastoncelli che viene attivata a -120 mV, scompare, tuttavia, quando si ottiene la corrente netta, mediante sottrazione della corrente residua dopo blocco da Cs (Fig. 5). E' pertanto probabile che il rimbalzo osservato nella corrente attivata nelle cc. bipolari rifletta la deattivazione della corrente presente al potenziale di mantenimento di -45 mV. Questo punto verrà comunque verificato procedendo, come fatto per bastoncelli, alla stima della corrente netta mediante sottrazione. COLLABORAZIONI: questa unità collaborerà con l'UDR di Milano negli studi sulla modulazione degli HCN2 nei topi mutanti. L'UDR di Milano produrrà un canale HCN2 mutato, ne caratterizzerà il livello di espressione, la dipendenza dal voltaggio e la sensibilità ai nucleotidi ciclici in oociti e/o in linee cellulari di mammifero quali CHO o HEK 293. Compito della nostra unità sarà di effettuare la valutazione funzionale del topo mutante in relazione all'acuità visiva temporale e di analizzere le proprietà dell'Ih nelle cellule bipolari, dove l'espressione di HCN2 è elevata negli animali normali. L'UDR di Milano fornirà anche anticorpi espressamente preparati per una verifica indipendente della distribuzione degli HCN fatta con anticorpi commerciali. Sempre in collaborazione con questa unità svilupperemo modelli specifici di correnti di membrana per fotorecettori e cellule bipolari. Membri dell'UDR di Milano (vedi: DiFrancesco, 1999) hanno già sviluppato modelli di corrente di membrana in cardiomiociti, modelli che, con opportune modifiche, si potrebbero adattare ai fotorecettori e alle cc bipolari. In collaborazione con l'UDR SISSA-Torre questi modelli saranno utilizzati per simulare le risposte in voltaggio dei fotorecettori e delle cellule bipolari. Con questa unità veranno anche elaborati modelli di risonanza e di amplificazione a banda passante. Con l'UDR SISSA-Torre analizzeremo le proprietà dei canali responsabili della risonanza amplificata. Con l' UDR SISSA-Menini la collaborazione consisterà soprattutto nello scambio di anticorpi e di protocolli per l' immunoistochimica. RISULTATI PRELIMINARI Fi. 1. Localizatione e distribuzione di HCN1 e HCN2 nella retina di topo Fig. 2. A) gradini di voltaggio di 2-s tra -10 to -120 mV in incrementi di 10 mV da una cellula bipolare. B) constante di tempo di attivazione della Ih in funzione del voltaggio. C) decorso temporale dell'attivazione a -110 mV (traccia in nero) e approssimazione con esponenziale singolo con costante di tempo di 166 ms. Fig. 3. Risposte ERG a stimoli luminosi modulati sinusoidalmente nel tempo (0.5, 5, 10 and 20 Hz). Nel grafico in basso: ampiezza della prima armonica in funzione della frequaenza dello stimolo Fig. 4. Micrografia a fluorescenza. HCN2 (in verde), nuclei (blu). La distribuzione è simile nei topi wt e negli AP+/-. Fig. 5. Corrente di membrana in voltage-clamp da un bastoncello in controllo, in presenza di 3 mM CsCl e dopo rimozione del CsCl. Nel pannello inferiore la corrente netta (traccia nera) è sovrapposta ad una curva esponenziale con costante di tempo di circa 28 msec, un valore consistente con quello di canali omomerici. Si noti l'assenza della corrente di deattivazione.