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Nella prima fase del progetto di ricerca, cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate con antigene T grande di virus SV40 (BEAS-2B) saranno coltivate fino a confluenza in fiasche da 75 cm2 in terreno di coltura specifico (BEGM, Clonetics). Successivamente le cellule saranno esposte per 3, 6, 12, 24 ore a (a) estratto di fumo di sigaretta (Caballero® senza filtro), preparato fresco mediante aspirazione con siringa e successivo gorgogliamento, attraverso una valvola a tre vie, nel terreno di coltura, o (b) estratto di matrice ambientale. Per la raccolta delle matrici ambientali verranno utilizzate delle membrane in fibra di vetro (12 x 18 cm) attraverso le quali durante il periodo di campionamento passeranno circa 200 metri cubi di aria. Di questi filtri sarà utilizzata una superficie di 2 x 2 cm, corrispondenti a 0.37 centimetri cubi di aria, che verrà messa in un becker aggiungendo 80 ml di toluene. Il becker verrà messo in agitazione su una piastra riscaldata (40°C) fino a quando il toluene non sarà evaporato e la membrana completamente digerita. Il "digerito" verrà risospeso in 5 ml di RPMI + DMSO 1%, quindi filtrato (filtro 0.45 mm). La risultante soluzione verrà poi conservata a 4°C. L'estratto di fumo di sigaretta e l'estratto di matrice ambientale saranno opportunamente filtrati e diluiti col terreno di coltura stesso a concentrazioni non letali (1-5%). Gli estratti di fumo di sigaretta e di matrice ambientale saranno analizzati mediante gas cromatografia/spettrometria di massa per la caratterizzazione delle classi di componenti in essi contenuti (es. idrocarburi, sostanze volatili, metalli, ecc.). Per valutare la vitalità cellulare, le cellule verranno piastrate ad una concentrazione di 10.000 cellule per pozzetto, in una piastra sterile per colture cellulari a 96 pozzetti. Dopo 24 ore il terreno verrà tolto e le cellule incubate con terreno contenente varie concentrazioni di estratto di fumo di sigaretta o di matrice. Al termine del periodo di incubazione (24 ore) verrà effettuato il test di citotossicità, basato sulla trasformazione di un sale tetrazolico (MTT) in cristalli di formazano nelle cellule metabolicamente attive e successiva rivelazione spettrofotometrica, per individuare le concentrazioni non letali per le cellule. In esperimenti separati le cellule saranno invece infettate con rinovirus per 30, 60, 180, 360 minuti. Sarà utilizzato rinovirus tipo 16 (RV16). Stock virali saranno preparati per infezione di monostrati di cellule sensibili (Ohio HeLa, MRC Common Cold Unit, Salisbury, UK). I valori TCID50/ml saranno determinati e il sierotipo specifico sarà confermato come RV16 mediante neutralizzazione con anticorpi specifici. Alle colture sarà aggiunta una quota di stock virale tale da avere una carica infettante pari a 1 virus per cellula. Le cellule, dopo ciascun stimolo, saranno raccolte e l'RNA totale verrà estratto mediante kit commerciale (Qiagen). Per questa parte dello studio saranno selezionati fino a un massimo di 90 geni potenzialmente candidati sulla base della letteratura internazionale come implicati nella risposta fisiopatologica (sia in senso proinfiammatorio che proneoplastico) agli stimoli usati. Questa parte della ricerca verrà eseguita in collaborazione col Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Chimica Biologica, Università di Modena e Reggio Emilia (Prof. Sergio Ferrari). L'RNA ottenuto dalle colture cellulari (100 nanogrammi per campione) sarà amplificato, convertito in cDNA mediante trascrizione inversa e analizzato per lo studio dell'espressione genica a bassa densità in real-time PCR con cartucce microfluidiche (Applied Biosystems Micro Fluidic Cards). Le piastre saranno realizzate su richiesta (Assays-on-DemandTM) contenenti i primers specifici per i geni di interesse. Ogni gene sarà saggiato, a ciascun tempo, su piastre a 384 pozzetti (volume 2 microlitri). Saranno inizialmente testati geni appartenenti a cinque diverse classi: stress ossidativo (es. HO-1, mt1, HSP70, junB), differenziamento/rimodellamento (es. cheratina 19, MMP1), apoptosi/antiapoptosi (es. mdm-2, bcl-2, id3), infiammazione (es. MKP-1, P-caderina, RELMgamma), metabolismo degli xenobiotici (es. CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4, GSTM1, GSTT1, NAT2). I trascritti marcati con sonde fluorogeniche, saranno analizzati in quadruplicato mediante real-time PCR per l'analisi quantitativa dell'espressione genica mediante rilevazione della fluorescenza (TaqMan Universal PCR Master Mix) con ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection Systems. L'analisi genica sarà comparata con quella ottenuta agli stessi tempi in cellule di controllo non esposte. Nella seconda fase del progetto di ricerca, una volta identificato il tempo di massima risposta (sia della up-regolazione che della down-regolazione genica), le stesse cellule saranno coltivate fino a tale tempo in presenza degli stimoli sopramenzionati per la successiva estrazione dell'RNA, conversione in cDNA a doppia elica mediante trascrizione inversa e successiva generazione di cRNA biotinilato usando biotin-11-CTP e biotin-16-UTP. Il cRNA sarà poi purificato usando colonne RNeasy (Qiagen) e le concentrazioni misurate per assorbimento UV. Successivamente i campioni saranno ibridizzati con identiche matrici (Affimetrix GeneChip arrays) per 16 ore. I GeneChips saranno quindi lavati, colorati, usando una amplificazione del segnale mediata da anticorpo, e le immagini ottenute saranno scannerizzate e processate con metodiche automatiche (Affimetrix Microarray Analysis Suite 5.0). Il livello di espressione di un singolo mRNA sarà determinata elaborando l'intensità di fluorescenza e comparandola con quella ottenuta negli altri campioni mediante appositi algoritmi di comparazione. L'analisi dei trascritti sarà confrontata con un set di librerie geniche commercialmente disponibile. L'analisi del profilo di espressione genica sarà effettuata, per ogni campione di RNA, in tre esperimenti indipendenti. Infine, nella terza fase del progetto di ricerca, allo scopo di verificare la possibile sinergia di effetto dei vari stimoli, verrà valutata mediante microarray l'espressione genica delle cellule bronchiali dopo stimolazione combinata. In particolare sarà studiata l'espressione dopo esposizione a fumo di sigaretta o estratto di matrice ambientale (considerati come stimoli di fondo) per 24 ore e successiva infezione con rinovirus per il tempo corrispondente alla massima modificazione di espressione genica rispetto al controllo negli esperimenti di esposizione separata.
