Bibliografia
1) De Flora S. et al., (2003) Mutation Res. 523/524, 237-252.
2) Hecht S.S., (1999) J. Natl. Cancer Inst. 91, 1194-1210.
3) Yang Y.-M., et al. (2002) Cancer Res. 62, 3-7
4) McLaughlin L. et al., (2000) J.Clin.Invest. 106, 1105-1113.
5) Gassler N. et al., (2001) Histol.Histopathol. 16, 755-762.
6) Bettuzzi S. et al., (2000) Cancer Res. 60, 28-34.
7) Pucci S. et al., (2004) Oncogene 02/02/2004 advance online pub.
8) July L.V. et al., (2002) Prostate 50, 179-188.
9) Scaltriti M. et al., (2004) Int. J. Cancer 108, 23-30.
10)Pegg A.E. et al., (1988) Cancer Res. 48, 759-774.
11)Murakami Y. et al., (1994) Biochem.J. 304, 183-187.
12)Ichimura S. et al., (1998) Biochem.Biopys.Res.Commun. 243, 518-521.
Livelli di espressione delle isoforme di clusterina nell'infiammazione e cancro del polmone La clusterina è nota da tempo come una glicoproteina eterodimerica di 70-80 kDa, presente in modo pressochè ubiquitario nei liquidi e nei tessuti di mammifero. Essa appare svolgere una molteplicità di funzioni assai diverse; un ruolo sicuramente importante è quello rappresentato nell'insorgenza e nella progressione di diversi tipi di tumore. I dati sperimentali più recenti dimostrano l'esistenza di più isoforme di questo prodotto genico; particolarmente importanti per il ruolo funzionale che ad esse viene attribuito, sono una forma glicosilata di secrezione, di peso molecolare di 70-80 kDa, per la quale è stata definita una funzione anti-apoptotica e quindi citoprotettiva e una forma non glicosilata monomerica, di circa 50-55 kDa, con tendenza ad accumularsi nel nucleo cellulare, dove sembra svolgere una funzione pro-apoptotica. L'esistenza di queste due isoforme. che sembrano svolgere ruoli opposti sul destino della cellula, possono spiegare risultati apparentemente contraddittori sul coinvolgimento della clusterina nella trasformazione tumorale. Attualmente la questione cruciale nella ricerca diretta a comprendere il ruolo della clusterina nel cancro è quella di stabilire quando, durante la crescita tumorale, e in quale modo l'una o l'altra delle due forme prevalga. Fra gli stimoli stressori che notoriamente inducono l'espressione della clusterina vi sono anche i processi di tipo infiammatorio come ad esempio la miocardite e il morbo di Crohn. E' ben noto che il fumo di sigaretta è causa di infiammazione e favorisce la trasformazione tumorale a livello dell'apparato respiratorio. Con la presente ricerca si vuole indagare il ruolo svolto dalla clusterina in questi processi. Pertanto verranno studiati modelli sperimentali costituiti da linee cellulari tumorali umane derivate dall'epitelio polmonare, da fibroblasti embrionali umani di polmone, da linee cellulari epiteliali umane di origine bronchiale immortalizzate. Queste cellule verrano esposte a fumo di sigaretta a dosaggi e tempi diversi. Su di esse si procederà quindi alla determinazione dell'attività del gene della clusterina e di vari altri geni di riferimento, come i marcatori di proliferazione cellulare: istone H3, Ki67 e i geni della biosintesi delle poliammine: ornitina decarbosilasi (ODC), adenosilmetionina decarbossilasi (AdoMetDC); verranno inoltre determinati i livelli di espressione di marcatori di quiescenza cellulare: "growth arrest specific gene 1" (GAS1) e i geni del catabolismo delle poliammine: spermidina/spermina N1-acetiltrasferasi (SSAT), ODC-antizima. La scelta di questo gruppo di geni è basata su nostre precedenti sperimentazioni che hanno dimostrato un loro coinvolgimento nei processi di crescita tumorale (Cancer Research 60, 28-34, 2000; Cancer Research 63, 3469-3472, 2003; Int. J. Cancer 108, 23-30 2004). L'attività genica verrà valutata titolando gli specifici trascritti mediante metodiche di ibridizzazione Northern e Real Time PCR (eseguita da D'Arca). Nel caso di proteine dotate di attività enzimatiche come ODC, AdoMetDC ed SSAT verrà anche determinata l'attività enzimatica in vitro (eseguita da Davalli). Per la clusterina verranno valutati i livelli delle varie isoforme mediante ibridizzazione Western, utilizzando anticorpi del commercio. Questi saranno impiegati anche per validare anticorpi monoclonali progettati da noi contro specifici epitopi della clusterina. L'obiettivo è quello di poter distinguere le isoforme della proteina, oltre che sulla base del peso molecolare (come risulterà dall'analisi Western), anche sulla base della diversità immunogenica, il che consentirebbe di ottenere un quadro più dettagliato delle singole isoforme. Negli stessi sistemi verrà valutato l'effetto di composti antiossidanti sull'espressione della clusterina e dei geni sopra citati. Tra gli antiossidanti impiegati particolare attenzione sarà rivolta all'N-acetilcisteina, al retinolo e ad alcuni composti polifenolici. Questa sperimentazione potrà aggiungere informazioni significative sulla risposta molecolare al fumo di sigaretta da parte delle cellule di origine polmonare; potrà quindi fornire indicazioni sulla possibilità di attivare specifici meccanismi di prevenzione del danno da fumo ed indicare obbiettivi per interventi terapeutici. La ricerca si svilupperà successivamente nella direzione di individuare la localizzazione delle varie isoforme di clusterina nel tessuto bronchiale. A questo scopo verranno applicate tecniche di immunoistochimica (eseguite da D'Arca) su biopsie bronchiali ottenute mediante fibrobroncoscopia. L'utilizzazione di anticorpi capaci di distinguere le diverse isoforme di clusterina consentirà di valutare, in diversi tipi di patologie infiammatorie, le variazioni quantitative delle isoforme e la loro localizzazione nello stroma o nell'epitelio del tessuto e in particolare nel citoplasma o nel nucleo delle cellule. Tutte queste informazioni potranno essere associate alle diverse patologie e quindi assumere potenzialmente un significato sia diagnostico che prognostico.
