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IPOTESI ED OBIETTIVI PRINCIPALI Ipotizziamo che la sovrapproduzione di 8-isoprostano e 4-HNE sia una caratteristica fondamentale dello sbilancio ossidanti/antiossidanti nel polmone dei fumatori con e senza BPCO. L'eccesso di 8-isoprostano e 4-HNE potrebbe causare, attraverso l'attivazione di fattori di trascrizione, il rilascio di mediatori infiammatori responsabili della persistenza dell'infiammazione nella BPCO. Pertanto, lo scopo dell'attuale progetto di ricerca sarà la dimostrazione della sopraccitata ipotesi tramite: 1) La valutazione del bilancio ossidanti/antiossidanti attraverso i marker di stress ossidativo e gli antiossidanti nei fumatori con e senza BPCO; 2) La valutazione del ruolo dell'8-isoprostano a della 4-HNE nell'attivazione dei percorsi di segnalazione intracellulari. MATERIALE, METODI, PROCEDIMENTI Pazienti, Disegno dello Studio e Valutazione della Funzione Polmonare Un campione di 20 fumatori "sani", 20 pazienti affetti da BPCO e 20 pazienti sani di controllo che non hanno mai fumato verrà reclutato per uno studio osservazionale trasversale. In accordo con le più recenti linee guida GOLD, la diagnosi di BPCO verrà confermata dalla spirometria: la presenza di un FEV1 postbroncodilatatore <80% del predetto in combinazione con un FEV1/FVC <70% confermerà la presenza di una limitazione del flusso non del tutto reversibile. Dati antropometrici, storia di fumo di tabacco, farmaci attualmente utilizzati per malattie respiratorie e d'altro genere e sintomi correlati alla malattia polmonare ostruttiva (asma e BPCO) verranno registrati con l'ausilio di un questionario predisposto a tale scopo. La spirometria globale e la misurazione della capacità di diffusione (fattore di transfer) per il monossido di carbonio, saranno eseguiti secondo le linee guida della European Respiratory Society per la standardizzazione dei test di funzionalità polmonare. Raccolta ed Analisi del Condensato dell'Aria Espirata (EBC) L'EBC sarà raccolto tramite un apparecchio predisposto a tale scopo (EcoScreen, Jaeger, Germany) che permette la raccolta del condensato tramite il raffreddamento dell'aria espirata ad almeno -30° C. Tale procedimento è non invasivo e consiste nel respirare aria ambiente attraverso un boccaglio collegato ad una valvola a doppia via, utilizzando uno stringinaso, a frequenza respiratoria normale e a volume corrente per 15 minuti. Il liquido raccolto verrà immediatamente suddiviso in provette Eppendorf che verranno conservate a -80° C in attesa delle analisi. Presenza e concentrazioni di 8-isoprostano, aldeidi, glutatione e vitamine nell'EBC verranno verificate attraverso la cromatografia liquida ad alta performance(HPLC). Raccolta e Processamento dell'Espettorato Indotto L'induzione e il processamento dell'espettorato saranno eseguiti secondo le procedure precedentemente pubblicate (Vignola et al. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158:1945-50). In breve, dopo una spirometria di base, ogni paziente sarà sottoposto ad un aerosol con soluzione salina ipertonica al 3%. I soggetti saranno invitati a tossire per espettorare in ampolle sterili da 50 ml. Al volume dell'espettorato indotto verrà aggiunto un pari volume di ditiotreitolo diluito con soluzione salina per ottenere una concentrazione dello 0,1%. Dopo l'omogenizzazione l'espettorato verrà centrifugato ad 800 x g per 10 minuti per separare il supernatante dalla parte cellulare. La conta delle cellule totali, la vitalità e la conta cellulare differenziale verranno verificate utilizzando metodi standard. Due ricercatori indipendenti leggeranno in cieco i vetrini. Il numero di cellule squamose verrà sottratto dal calcolo totale delle cellule e la conta differenziali delle cellule verra espressa come percentuale corretta. Nel supernatante la concentrazione di 8-isoprostano, aldeidi, proteasi/antiproteasi (MMP1, MMP2, MMP9; TIMP1) verrà verificata tramite test ELISA o tramite HPLC. Sulla frazione cellulare l'attivazione di NFkB e c-Jun (AP1) sarà verificata tramite Western Blot. Raccolta, Processamento e Conservazione dei Campioni di Sangue 20 ml di sangue periferico verranno raccolti utilizzando EDTA come anticoagulante. Le provette di sangue saranno protette dalla luce per prevenire eventuali modificazioni delle componenti fotosensibili. I campioni verranno centrifugati per separare il plasma dalla componente cellulare. Quindi il plasma verrà surgelato a -80° in attesa delle analisi. Le concentrazione di molecole ossidanti ed antiossidanti saranno valutate nel plasma e/o nel lisato cellulare. Glutatione (GSH), GSH perossidasi e reduttasi, catalasi, superossido dismutasi (SOD) e 8-isoprastano saranno valutati facendo ricorso ai kit ELISA. 4-HNE e vitamina E saranno misurati tramite HPLC. Inoltre, le cellule mononucleate e i neutrofili del sangue periferico verranno coltivati per valutare (di base e dopo la stimolazione con ossidanti e/o antiossidanti): A) rilascio di mediatori infiammatori come IL8, IL6, IL11, TNF-alfa, RANTES; B) rilascio di antiossidanti: GSH, GSH perossidasi e reduttasi, catalasi, SOD; C) rilascio di proteasi/antiproteasi; D) rilascio di 8-isoprostano e 4-HNE; E) espressione di NFkB e AP1. Colture cellulare Al fine di valutare l'ipotizzata azione dell'8-isoprostano e della 4-HNE nell'attivazione di percorsi intracellulari, le sopraccitate colture cellulari verranno esposte a tali sostanze e le curve dose-risposta e tempo-risposta verranno valutate per stabilire la migliore concentrazione e il tempo ottimale di incubazione in grado di indurre o modulare il rilascio di mediatori infiammatori.
