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Questo studio ha come scopo la valutazione dell'espressione di varie proteine-chinasi (c-kit, PDGFR-α, PDGFR-β, c-met e del recettore del peptide gastrina-rilasciante o "gastrin-releasing peptide, GRP) nell'intero spettro delle proliferazioni neuroendocrine (NE) del polmone in pazienti fumatori. Nello studio sarà anche determinata la presenza di possibili mutazioni costituzionali dei geni delle proteine-chinasi. Le proliferazioni NE polmonari saranno definite morfologicamente secondo l'ultima classificazione dei tumori del polmone dell'OMS. Campioni operatori di parenchima polmonare non-neoplastico di pazienti fumatori saranno anch'essi analizzati per determinare l'espressione delle proteine-chinasi nelle fasi precoci delle alterazioni fumo-indotte nelle cellule NE. La ricerca sarà organizzata nelle seguenti fasi principali: 1) Selezione della casistica. Saranno raccolti casi di proliferazione delle cellule NE del polmone riscontrati in pazienti fumatori. In particolare, saranno selezionate le seguenti entità patologiche: iperplasia diffusa delle cellule NE, tumorlet, carcinoidi tipici ed atipici, carcinomi NE a grandi cellule, carcinomi a piccole cellule. Saranno inoltre raccolti campioni di parenchima polmonare (di fumatori e non-fumatori), prevelati chirurgicamente in pazienti con pneumotorace spontaneo. Solo le resezioni chirurgiche di polmone saranno incluse nello studio, allo scopo di ottenere un quadro morfologico rappresentativo di queste lesioni e prevenire errori di campionamento. I casi saranno raccolti dagli archivi di Laboratori di Anatomia Patologica (Dipartimento di Servizi Diagnostici dell'Università di Modena, Unità Operative di Anatomia Patologica degli Ospedali Civili di Reggio Emilia, Mestre e La Spezia). Subito dopo gli interventi chirurgici, tutto il materiale in esame è stato fissato in formaldeide tamponata al 4% e processato come di abitudine per l'esame istopatologico (disidratazione, inclusione in paraffina, taglio, colorazione con ematossilina-eosina). Quando possibile , alcuni frammenti di tumore saranno rimossi prima della fissazione in formaldeide, congelati in azoto liquido e stoccati in ultrafreezer a –80°C. Di ogni paziente saranno raccolti i parametri clinico-patologici che comprendono: età, sede e dimensione del tumore, stadio secondo il sistema TNM, la sintomatologia d'esordio, il tipo di trattamento e la sopravvivenza. Per l'inclusione dei casi nello studio, oltre alla morfologia NE, sarà richiesta una conferma immunoistochimica con positività per almeno uno dei marker di differenziazione NE (cromogranina A, sinaptofisina, CD56/NCAM). Saranno studiati almeno 50 casi di iperplasia diffusa delle cellule NE ed di tumorlet, e 100 casi di ognuna delle differenti entità tumorali NE, comprendenti carcinoidi tipici ed atipici, carcinomi NE a grandi cellule e carcinomi a piccole cellule. Tutte le lesioni saranno riclassificate secondo la più recente classificazione dei tumori polmonari dell'OMS. 2) Analisi di espressione. L'immunoistochimica sarà effettuata in tutte le proliferazioni NE per la valutazione dell'espressione di c-kit, PDGFR-α, PDGFR-β, c-met e del recettore di GRP. Sarà inoltre valutata anche l'interazione (autocrina versus paracrina) tra i recettori e i corrispettivi ligandi (c-kit/Stem Cell Factor; PDGFR/PDGF; c-met/Hepatocyte Growth Factor; recettore del GRP/GRP). Al fine di rendere più fattibile e standardizzata l'analisi dell'espressione delle proteine-chinasi, sarà applicata la tecnologia dei microarray istologici. Questa nuova metodica universalmente adottata permette di valutare simultaneamente ogni marker immunoistochimico su un ampio numero di campioni. La metodica richiede l'identificazione di aree rappresentative delle lesioni NE e del parenchima polmonare da blocchetti in paraffina, da cui saranno rimosse minute biopsie utilizzando una strumentazione di precisione dedicata (Tissue Arrayer, Beecher Instruments, Silver Springs, MD, USA). Da due a tre biopsie (del diametro di 0.6-1 mm) saranno prelevate da ogni blocchetto originale per essere inserite in un nuovo blocchetto in paraffina. Il blocchetto così ottenuto sarà tagliato con un microtomo standard e ogni sezione contenente tutti i campioni prelevati potrà essere utilizzata per le colorazioni standard di imunoistochimica. Sezioni dello spessore di 4 micron saranno tagliate dai blocchetti inclusi in paraffina e portate all'acqua. Le perossidasi endogene saranno bloccate con una miscela di etanolo e di perossido di idrogeno allo 0.75%. Gli anticorpi monoclonali e policlonali diretti contro i vari antigeni testati sono commercialmente disponibili e saranno ordinati da appropriati fornitori. L'immunoistochimica sarà effettuata su sezioni consecutive utilizzando il sistema di amplificazione alla streptavidina-biotina-perossidasi in un immunocoloratore automatizzato (Benchmark, Ventana, Tucson, AZ, USA). Quando richiesto, saranno impiegati metodi di smascheramento antigenico per migliorare la sensibilità degli anticorpi. La valutazione delle colorazioni sarà effettuata indipendentemente da due patologi al microscopio ottico. Saranno riportati i seguenti parametri: presenza o assenza dell'immunoreattività, il tipo(i) di cellula che mostra una reazione positiva (cellule tumorali, stromali, endoteli, epitelio alveolare), e la percentuale delle cellule immunopositive. L'intensità di colorazione sarà inizialmente valutata utilizzando una scala arbitraria semi-quantitativa (negativo, 1+, 2+, 3+). Per quantificare l'intensità di colorazione sarà possibile utilizzare un sistema computerizzato di analisi di immagine (Eureka, Menarini, Firenze, Italia). 3) Analisi mutazionale dei geni. Il DNA genomico ottenuto da tessuto incluso in paraffina e/o tessuto fresco congelato sarà processato secondo le procedure standard. La microdissezione laser sarà effettuata con diretta osservazione del campione in un microscopio invertito utilizzando sezioni rappresentative del campione, di 5 micron di spessore, colorate con ematossilina-eosina ma non montate con vetrino copri-oggetto. A tal fine, sarà utilizzato uno strumento per microdissezione laser (Olympus IX70, Laser Scissors Pro300, Olympus Italia, Segrate, Milano, Italia) comandato dall'operatore mediante apposito "joystick" elettronico. La microdissezione laser assicura che il DNA prelevato dalle cellule sia di alta qualità e non presenti contaminazioni da parte di altri tipi di cellule. L'estrazione del DNA dalle cellule estratte è svolta utilizzando il QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Specifiche regioni codificanti dei geni c-kit (esoni 9 e 11), PDGFR-α (esoni 9, 12, e 14), PDGFR-β (esoni 14, 15 e 16), c-met (esoni 14-21) e recettore del GRP (esoni 1, 2, e 3) saranno amplificate con reazione di polimerasi a catena (PCR) utilizzando Ampli Taq Gold (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) e coppie specifiche di oligonucleotidi. Dopo purificazione dei prodotti di PCR con QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), il materiale risultante sarà sottoposto a elettroforesi su gel di agarosio e visualizzato con colorazione di etidio bromuro. Il sequenziamento diretto del DNA sarà effettuato con ABI BigDye terminators (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ed il sequenziatore automatico ABI-Prism 310 DNA sequencer (Applied Byosystems, Applera Italia, Monza) seguendo le procedure standard e le indicazioni fornite dalla ditta produttrice. Le sequenze così ottenute saranno confrontate con quelle già pubblicate nelle Banche dei Geni per identificare la presenza di possibili mutazioni nei geni delle proteine-chinasi. 4) Valutazione statistica. I dati ottenuti dalle analisi di espressione e dagli studi di mutazione genica saranno valutati nei diversi tipi di proliferazione NE del polmone, che comprende iperplasia, tumorlet, carcinoidi, carcinomi NE a grandi cellule, carcinomi a piccole cellule. Successivamente, i dati saranno correlati con i parametri clinico-patologici, precedentemente raccolti per ogni caso. Saranno impiegati diversi test statistici (tavole di contingenza e significatività secondo il test del chi-quadro di Pearson; sopravvivenza secondo le curve di Kaplan-Meier e significatività testata con il log-rank test; analisi univariata e multivariata con calcolo del rischio relativo secondo la regressione di Cox) mediante un appropriato software (SPSS versione 10.0, Chicago, IL, USA). Risultati attesi: La raccolta di lesioni NE del polmone ottenute da resezione chirurgica e correlate a fumo è l'aspetto preliminare di questo studio. Sarà così raggiunta una quantità fondamentale di materiale per poter ottenere una valutazione clinico-patologica globale di queste proliferazioni, alcune delle quali appaiono veramente rare e abitualmente riportate in letteratura come singoli casi. Mediante l'utilizzo dell'immunoistochimica, ci si attende di identificare per la prima volta e in una casistica adeguatamente ampia l'espressione di specifici recettori protein-chinasici e dei corrispettivi ligandi lungo l'intero spettro delle lesioni NE del polmone. Tutto questo consentirà di determinare la presenza di meccanismi autocrini e/o paracrini diversi e/o simili in ogni distinta entità patologica NE. Insieme alle correlazioni clinico-patologiche, questi dati potrebbero risultare di importanza cruciale nel valutare l'esistenza di una condizione preneoplastica nello sviluppo dei carcinomi NE del polmone, definendo un modello di progressione tumorale anche per queste lesioni. Gli studi molecolari sono principalmente mirati alla dimostrazione della presenza di eventuali mutazioni costitutive in precise regioni dei geni delle proteine-chinasi. Gli esoni scelti codificano infatti per domini proteici di recettori che possono essere bloccati da inibitori farmacologici selettivi.
