RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

FUMO DI TABACCO, INFIAMMAZIONE E CANCRO DEL POLMONE: ASPETTI MOLECOLARI, BIOLOGICI, CLINICI E ANATOMOPATOLOGICI

Università di riferimento

Università degli Studi di PAVIA - SCIENZE EMATOLOGICHE, PNEUMOLOGICHE E CARDIOVASCOLARI MEDICHE E CHIRURGICHE - PAVIA(PV)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Anna Maria FIETTA

Descrizione

Dall'analisi dei dati preliminari della letteratura si evince come l'esatto ruolo patogenetico delle cellule T regolatorie specificamente dirette contro antigeni tumorali debba essere ancora chiarificato. Il nostro gruppo di ricerca è da tempo impegnato nella valutazione del ruolo delle cellule Treg, soprattutto il subset CD4+CD25+, nell'outcome di pazienti sottoposti a trapianto polmonare o cardiaco (38,40,57-60). Inoltre, alcuni risultati preliminari ottenuti su di un numero limitato di pazienti con neoplasia polmonare primitiva ci hanno permesso di confermare la presenza di una significativa espansione dei cloni regolatori CD4+CD25+ e CD8+CD28-, soprattutto nei pazienti con tumore del polmone in stadio avanzato. In tre soggetti si è anche dimostrato che il subset CD4+CD25+ possiede azione regolatoria in vitro ed esprime, a differenza del subset CD4+CD25-, alti livelli di Foxp3 (Brief Report in corso di stesura). Pertanto, sulla base dell'esperienza acquisita nello studio del fenotipo e funzioni delle cellule Treg, dell'interesse dei risultati preliminari ottenuti nei pazienti con tumore del polmone primitivo e considerando l'incidenza e l'elevato tasso di mortalità di questo tumore, si ritiene utile approfondire la valutazione del ruolo svolto dalle cellule T regolatorie/soppressorie CD4+CD25+ e CD8+CD28-, sia a livello periferico che intratumorale, in questa neoplasia. Il progetto di ricerca si propone di: 1. Evidenziare se esiste una correlazione tra il grado di espansione di uno o entrambi i subset di cellule regolatorie, sia a livello periferico che intratumorale, ed il tipo istologico, lo stadio, o l'outcome della neoplasia polmonare. Se tale correlazione esiste, si cercherà di evidenziarne l'utilità dal punto di vista clinico-prognostico; 2. Verificare, qualora la valutazione della frequenza dei diversi subset di effettori regolatori risultasse utile dal punto di vista clinico o prognostico, se la stessa può essere surrogata dalla valutazione dell'espressione del gene Foxp3, come indice globale dell'attività regolatoria; 3. Valutare l'influenza dei diversi protocolli terapeutici attualmente in uso sulla frequenza delle cellule Treg, con particolare riguardo all'ablazione con radiofrequenza (RFA). Questa è una metodica terapeutica scarsamente invasiva che trova impiego soprattutto nel trattamento locale di tumori epatici non operabili, e di recente proposta per il trattamento di numerosi tumori primari e secondari, compresi quelli del polmone, sempre in pazienti per i quali non sia possibile attuare l'opzione terapeutica chirurgica (61-63). La RFA è praticata da alcuni anni da alcuni partecipanti al progetto (64-68). Il meccanismo alla base dell'azione anti-tumorale dell'ablazione con radio-frequenza non è attualmente noto. La maggior parte degli studi pubblicati, infatti, mirava soprattutto all'ottimizzazione dell'RFA sia dal punto di vista fisico che termico, senza prendere in considerazione l'eventuale effetto del trattamento su potenziali bersagli immunologici. Studi preliminari condotti nell'animale sembravano indicare che la termoablazione induceva una marcata reazione infiammatoria, con infiltrato linfo-plasmacellulare (69). Tuttavia, questi risultati non sono stati confermati nell'uomo. Infatti, Schell e collaboratori (70), che hanno misurato i livelli di alcune citochine e recettori per le citochine nel plasma di pazienti con tumori epatici primari o metastatici non operabili e sottoposti ad ablazione con radiofrequenza, non hanno osservato alcuna variazione nei parametri studiati, concludendo che la RFA non stimola le cellule di Kupffer o altri macrofagi epatici a produrre citochine pro-infiammatorie, a differenza di quanto osservato con la crioterapia. Recentemente, in un modello di carcinoma epatico nel ratto, Wissniowski e collaboratori (71) hanno evidenziato in tutti gli animali sottoposti a RFA la presenza di una densa infiltrazione T linfocitaria, associata alla presenza in circolo di linfociti T attivati specifici per gli antigeni tumorali. Sulla base di queste osservazioni, gli autori hanno formulato l'ipotesi che l'ablazione con radio-frequenza, oltre a distruggere il tessuto tumorale, sia in grado di indurre una risposta immune specifica verso gli antigeni tumorali favorendo la presentazione di antigeni tumorali mascherati, ed in ultima analisi annullando la tolleranza immunologia verso il tumore. Poiché le cellule Treg rappresentano un importante meccanismo capace di indurre e mantenere la tolleranza immunologia al self e al non self è verosimile supporre che l'ablazione con radiofrequenza possa modulare anche questi effettori regolatori. Il protocollo di ricerca prevede DUE FASI: 1. PRIMA FASE: si incentrerà sulla valutazione della possibile correlazione tra la frequenza delle cellule T CD4+CD25+ e delle cellule T CD8+CD28- a livello periferico o intratumorale ed il diverso tipo istologico, lo stadio clinico e l'outcome dei pazienti. A tale scopo verranno arruolati, presso il DH oncologico ed il reparto della Clinica di Malattie Respiratorie dell'IRCCS San Matteo di Pavia e la Chirurgia Toracica dello stesso Policlinico, pazienti con neoplasia polmonare primitiva, prima di essere sottoposti a chirurgia, radioterapia o chemioterapia. Verranno, pertanto, esclusi tutti i pazienti con neoplasia polmonare secondaria o già trattati, pazienti con malattie concomitanti riconosciute capaci di modulare la risposta immunitaria o soggetti in trattamento con corticosteroidi ad alte dosi o altri farmaci immunosoppressori. In base alla casistica del nostro ospedale, si prevede di poter arruolare in questa prima fase dello studio (della durata di circa 18 mesi) circa 100 pazienti, rispondenti ai criteri di inclusione ed esclusione precedentemente illustrati. Un gruppo di almeno 40 volontari sani, appaiati per sesso, età ed attitudine al fumo, costituirà la popolazione di controllo. La frequenza ed il fenotipo delle cellule Treg periferiche verrà analizzato mediante citofluorimetria su sangue periferico; in particolare si valuterà l'espressione o la mancata espressione a seconda del subset considerato dei seguenti antigeni extra ed intra-cellulare CD4, CD8, CD25, CD28, CD27, CD152 e GITR. Le cellule regolatorie verranno purificate mediante Facs Scan o separazione immunomagnetica con micro-beads per la successiva valutazione in vitro della loro attività regolatoria/soppressoria, della produzione di IL10 e/o TGF-beta (mediante metodica ELISPOT o ELISA), per la valutazione della espressione del gene Foxp3 (mediante Real Time PCR quantitativa) e il dosaggio intracellulare del prodotto genico, Scurfin, mediante analisi citofluorimetrica (infatti, attualmente è in fase di sviluppo un anticorpo monoclonale per l'evidenziazione intracellulare dello Scurfin in citofluorimetria). La valutazione delle cellule Treg intratumorali verrà attuata mediante l'analisi immunoistochimica di sezioni della neoplasia ottenute in seguito ad asportazione chirurgica e/o dopo purificazione dei linfociti T infiltranti (TIL) il tumore. La cohorte di pazienti sarà seguita longitudinalmente dal punto di vista clinico e le cellule regolatorie verranno monitorate a livello del sangue periferico durante l'intero follow-up clinico del paziente. I risultati conseguiti al termine di questa fase dello studio permetteranno di raggiungere i primi due obiettivi della ricerca. 2. SECONDA FASE: consisterà, invece, nella valutazione del possibile meccanismo immunoregolatore della ablazione tumorale con radiofrequenza. A tale scopo si attuerà un'attenta valutazione dei soggetti che nel corso della durata del presente progetto verranno sottoposti a tale trattamento, presso l'IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia. Sulla base dell'esperienza accumulata presso il nostro ospedale, dove la termoablazione viene utilizzata da circa due anni anche nel trattamento del tumore polmonare primitivo o metastatico non operabile, si stima di poter arruolare almeno 10 pazienti con tumore polmonare primitivo nel corso della durata del presente progetto. La valutazione delle cellule Treg periferiche verrà attuata prima della ablazione tumorale con radiofrequenza e dopo la stessa ad intervalli regolari (7-30-60-180 giorni dopo il trattamento). Questa seconda fase della ricerca della durata di circa 6 mesi permetterà di conseguire il 3° obiettivo dello studio. METODICHE UTILIZZATE: Identificazione e studio fenotipico delle sottopopolazioni Treg in citofluorimetria Per l'analisi citofluorimetrica si utilizzeranno 50 microl di sangue intero eparinato a cui verranno aggiunti 50 microl di PBS contenente 0.2 % di albumina bovina e 0.02% di sodio azide (PBS-MoAb) per ogni provetta. Il sangue così ripartito verrà marcato con i seguenti anticorpi monoclonali (5 microl per provetta): CD3FITC, CD4PE, CD8PE, CD4Cy5.5, CD69PE, CD25FITC, CD3PerCP, CD28FITC (Becton Dickinson, San Jose, California, USA). Come controllo si utilizzerà una IgG dello stesso isotipo (Becton Dickinson). Specificatamente per ogni campione di sangue verranno allestite le seguenti provette: 1) IgG1 FITC/IgG1 PE; 2) CD3 FITC + CD4 PE; 3) CD3 FITC + CD8 PE; 4) CD4 Cy5.5 + CD69 PE + IgG1 FITC; 5) CD4 Cy5.5 + CD69PE + CD25 FITC; 6) CD3 PerCP + CD8PE + IgG1 FITC; 7) CD3 PerCP + CD8PE + CD28 FITC. Le cellule verranno incubate per 30 minuti al buio a + 4°C, lavate con PBS e sospese in PBS per essere analizzate al citofluorimetro (FacsCalibur, Becton Dickinson); i dati verranno analizzati con software Cell Quest. I linfociti verranno identificati e selezionati in base ai parametri fisici di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). Nel gate identificato verranno valutate le percentuali dei T linfociti maturi (CD3+) e le sottopopolazioni CD3+CD4+ e CD3+CD8+. I subset CD4+CD25+ e CD8+CD28- verranno identificati tramite i parametri fisici (FSC e SSC) e riconosciuti per la positività alle specifiche marcature. Su questi subset si valuterà inoltre l'espressione di altri marcatori: CD152 e CD103 (per le cellule CD4+CD25+); CD27 per le cellule CD8+CD28-. Preparazione delle cellule Le cellule mononucleate verranno isolate da sangue venoso periferico mediante gradiente di densità su Ficoll (Amersham, Uppsala, Svezia). Per la separazione dei T linfociti infiltranti (TIL) il tumore, campioni di tumore verranno raccolti al momento della biopsia o dell'intervento chirurgico e verranno utilizzati per le valutazioni immunoistochimiche o per la separazione dei T linfociti infiltranti il tumore. In quest'ultimo caso, i pezzi bioptici verranno frammentati e sottoposti a digestione enzimatica per 2 ore con collagenasi (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, St louis, MO), 2.5 unità/ml di ialuronidasi (Sigma-Aldrich) e 0.1 mg/ml di Dnasi (Sigma-Aldrich). Separazione immuno-magnetica delle cellule Treg La separazione delle cellule T CD4+CD25+ e CD8+CD28- verrà attuata mediante due step. Il primo step consisterà nella separazione immuno-magnetica delle cellule T CD4+ o CD8+. Nel primo caso si utilizzerà il "CD4+ T cells Isolation Kit II" (Miltenyi Biotec) che permette l'eliminazione di tutte le cellule non Th (cellule B, monociti, NK, cellule T citotossiche, cellule dendritiche, piastrine ecc.), mentre per la separazione delle CD8+ si utilizzerà il "CD8+T cell isolation Kit II" che consente l'eliminazione delle cellule T CD4+, cellule T gamma/delta, cellule dendritiche, monociti, granulociti, cellule B, eritrociti e cellule NK. Il secondo step prevede la deplezione delle cellule Th CD4+ che esprimono l'antigene CD25 o delle cellule CD8+ che esprimono il CD28, mediante l'impiego di CD25 MicroBeads e CD28-FITC + anti-FITC MicroBeads (Miltenyi Biotec). Le cellule marcate con le MicroBeads verranno separate in una colonna, localizzata in un campo magnetico generato da un separatore MACS. Le cellule T CD4+CD25+ o quelle CD8+CD28+ verranno trattenute sulla colonna, mentre le cellule CD25- e CD28- non marcate che fluiscono dalla colonna saranno raccolte e conservate. Dopo la rimozione della colonna dal campo magnetico, si procederà alla eluizione della frazione CD4+CD25+ e CD8+CD28+. La purezza di entrambe le frazioni verrà verificata mediante analisi citofluorimetrica. Determinazione della proliferazione cellulare La capacità del subset CD4+CD25+ di inibire la proliferazione del subset CD4+CD25- sarà testata in vitro utilizzando una metodica citofluorimetrica che si avvale dell'uso di un colorante vitale il CFDA-SE o carbossifluoresceina diacetato, succinimidil estere (72). Questa metodica permette di analizzare le fasi di proliferazione fino a 10 cicli cellulari. Il subset CD4+CD25- sarà marcato con il probes fluorescente, quindi le cellule saranno co-coltivate con il subset CD4+CD25+ in presenza di adeguati stimoli per indurre la proliferazione. Dopo 7 giorni la co-coltura sarà sacrificata e, previa opportuna marcatura tesa ad identificare la popolazione, si determinerà la percentuale di cellule figlie, identificate per mezzo della ridotta positività al probe CFSE. Valutazione funzionale delle cellule Treg La produzione di citochine da parte dei cloni Treg verrà determinata mediante la metodica ELISPOT (73). Brevemente: piastre da 96 pozzetti (Polyfiltronics, Rockland, MA) verranno rivestite con 100 microl di anticorpi di cattura, specifici per IL10 o TGF-b (IL10: clone 9D7, Endogen, Woburn MA; TGF-b polyclonal, R&D Systems, Minneapolis MN) in PBS overnight a 4°C. Le piastre verranno successivamente lavate e bloccate per 2 ore; a ciascun pozzetto verranno aggiunte 1-3x105 cellule Treg purificate mediante separazione magnetica. Le cellule saranno stimolate con mitogeni aspecifici (Pha o ConA) o anticorpi anti-CD3+, anti-CD28. Dopo un'incubazione di 24-48 ore a 37°C le piastre saranno lavate e si aggiungeranno 100 microl di anticorpo biotinilato di rivelazione (IL10: clone 12G8, Endogen; TGF-b policlonale, R&D Systems) per 2 ore a 37°C. Dopo lavaggio verranno aggiunti 100 microl di HRP-Conjugated Streptavidin (Endogen) ad ogni pozzetto per 30 min a temperatura ambiente. Le piastre saranno ulteriormente lavate e gli spot verranno sviluppati utilizzando 3-amino-9-ethylcarbazolo (Sigma) diluito 1:30 in tampone acetato 0.1 M, filtrato e addizionato di 15 ul di H2O2. Gli spot saranno quindi contati utilizzando un sistema di analisi automatizzato (A.EL.VIS: Automated Elisa-Spot Video Analysis System, Hannover, Germany). I risultati verranno espressi come numero di spots per 105 cellule seminate. Valutazione dell'espressione del gene Foxp3 L'analisi quantitativa dell'espressione del gene Foxp3 verrà attuata mediante Real-Time PCR. L'RNA verrà estratto mediante l'impiego del kit "Rneasy Mini Kit" (Qiagen, Valencia, California, USA) seguendo la procedura raccomandata nelle istruzioni. Il cDNA verrà preparato incubando con 2.5 uM di random hexamers (Applied Biosystems Inc, Foster City, California, USA) e l'amplificazione verrà sviluppata in un volume totale di 25 ul per 40-50 cicli di 15 secondi a 95°C, un minuto a 60°C. Il prodotto verrà evidenziato usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems Inc, Foster City, California, USA). Ogni campione verrà processato in triplicato e l'espressione di Foxp3 verrà normalizzata rispetto al gene GAPDH. Le sequenze dei primer utilizzati sono le seguenti: per GAPDG: 5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3' e 5'GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3'; per FoxP3: rispettivamente 5'-GAAACAGCACATTCCCAGAGTTC-3' e 5'-ATGGCCCAGCGGATGAG-3'. TEMPI PREVISTI: 1° Anno: inizio delle Fasi 1 e 2 2° Anno: completamento delle Fasi 1 e 2. RISULTATI ATTESI: Fase 1: Definire il ruolo delle cellule Treg nel tumore polmonare, in relazione allo stadio e al tipo istologico della neoplasia e all'outcome del paziente. Evidenziare se la misurazione dell'espressione di Foxp3 o dei livelli intracellulari di Scurfin può essere usata come indice globale di attività regolatoria. Fase 2: Valutare la possibile azione dell'ablazione con radiofrequenza sulle cellule Treg periferiche.