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Programma di ricerca
Analisi della capacita' dei Toll-like receptors (TLR) di modulare le funzioni effettrici e regolatorie delle cellule dell'immunita' innata
Università di riferimento
Universita' degli Studi di ROMA -
MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA - ROMA(RM)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Gabriella PALMIERI
Descrizione
Questo progetto di ricerca e' teso a caratterizzare la capacita' di TLR3 e TLR9, un sottogruppo di TLR specifici per acidi nucleici, di modulare le funzioni effettrici e regolatorie delle cellule NK umane, con particolare attenzione al ruolo svolto nella sopravvivenza e nelle funzioni di altre cellule dell'immunita' naturale. Le relazioni fra i diversi partecipanti alla risposta innata, infatti, non determinano soltanto l'intensita' e l'efficacia della risposta infiammatoria contro i patogeni, ma dettano e istruiscono anche la fase adattativa T-dipendente della risposta immunitaria. Il lavoro svolto recentemente nel nostro gruppo ha permesso di evidenziare la capacita' di dsRNA, il ligando specifico di TLR3, di modulare il comportamento funzionale delle cellule NK; il nostro progetto intende analizzare, in parallelo, la capacita' delle cellule NK di riconoscere direttamente e di rispondere ad acidi nucleici di origine microbica (dsRNA (ligando di TLR3), e oligonucleotidi ricchi in sequenze CpG non metilate, CpG ODN (riconosciuti da TLR9)). Lo studio analizzera': l'espressione, la modulazione e la compartimentalizzazione dei TLR, in seguito a stimolazione con citochine, o dopo aggregazione di recettori attivatori od inibitori; l'effetto dei ligandi specifici sulle funzioni delle cellule NK (citotossicita', produzione di citochine e chemiochine); le vie di segnalazione intracellulare iniziate dai TLR, ed il loro ruolo nelle diverse risposte funzionali. Inoltre, confronteremo alcuni degli eventi intracellulari innescati dallo stesso TLR in cellule diverse dell'immunita' innata, per comprendere il ruolo giocato dall'ambiente cellulare nella capacita' segnalatoria e funzionale dei TLR. Infine, valuteremo la capacita' dei ligandi dei TLR di modificare il programma apoptotico di cellule NK in risposta all'aggregazione del CD16, studiando in particolare le vie che coinvolgono i componenti della famiglia dei "recettori di morte" (TNFR I, FAS). Il nostro studio utilizzera' due sistemi cellulari: 1. popolazioni policlonali di cellule NK umane, ottenute mediante una co-coltura a breve termine di cellule mononucleate di sangue periferico di donatori sani con una linea B linfoblastoide EBV+ (Pisegna S., et al. J. Immunol., 2002; 169: 68-74), altamente purificate (>98%) mediante selezione immunomagnetica. 2. un pannello di linee tumorali umane a fenotipo NK, che esprimono omogeneamente diversi recettori attivatori ed inibitori, e sulle quali abbiamo valutato l'espressione di TLR3 (Pisegna & Palmieri, osservazioni preliminari). I ligandi utilizzati nello studio sono il dsRNA sintetico poly I:C, ed i seguenti oligodeossinucleotidi: ODN 2006 5'-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3' (Bernasconi et al., Science 298: 2199-2202; 2002); ODN 2216, 5'-GGGggacgatcgtcgGGGGG-3' (Hornung et al., J. Immunol. 168: 4531-4537; 2002); ODN 5'ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3' (Auricchio et al., Cell. Microbiol. 5: 913-920; 2003), ligandi per TLR3 e TLR9, rispettivamente. Questo studio costituira' uno strumento conoscitivo rilevante per una migliore comprensione delle vie intracellulari di segnalazione innescate dal riconoscimento di componenti molecolari microbici, che regolano l'attivazione, le funzioni e la sopravvivenza delle cellule NK. Le informazioni scaturite dai risultati dello studio aiuteranno a definire le basi molecolari che regolano l'attivazione, la proliferazione e la persistenza di questo effettore della risposta innata nel sito d'infezione, e rappresenteranno una base razionale per la progettazione di strategie di immunointervento tese a potenziare o ripristinare le funzioni NK in un ampio spettro di patologie infettive. Inoltre, le nuove conoscenze acquisite in questo studio miglioreranno la comprensione delle modalita' attraverso le quali il riconoscimento dei patogeni mediato dai TLR modula la capacita' delle cellule NK di interagire con le altre cellule della risposta innata. Il progetto di ricerca e' articolato nei seguenti obiettivi: 1. Analisi dell'espressione di TLR3 e TLR9 in cellule NK umane. Evidenze ottenute nel nostro laboratorio sull'espressione di TLR3 in diverse popolazioni NK umane (Pisegna & Palmieri, manoscritto in preparazione), confermano ed estendono osservazioni recenti in letteratura (Schmidt K.N., et al., J. Immunol., 2004, 172:138). L'espressione di TLR9 su cellule NK umane e' stata ancora poco indagata (Hornung V., et al., J. Immunol., 2002, 168:4531); i nostri dati preliminari, ottenuti mediante RT-PCR, mostrano che popolazioni altamente purificate (>99%) di cellule NK umane, quiescenti o attivate a breve termine in vitro, esprimono l'mRNA per TLR9 (Pisegna & Palmieri, osservazioni preliminari). L'espressione di alcuni TLR puo' essere modulata, in dipendenza dallo stato differenziativo o di attivazione; il nostro studio analizzera' se i livelli di TLR3 e TLR9 sono influenzati da: a. la stimolazione con citochine: ci concentreremo sia sulle citochine principalmente coinvolte nelle risposte innate contro i patogeni (IL-15, IL-12, IL-18, IFN tipo I, IFN gamma, TNF alfa), che sull'IL-2, che e' in grado di potenziare le attivita' funzionali delle cellule NK; b. l'aggregazione di recettori di superficie, che sono coinvolti nelle comunicazioni intercellulari con le cellule bersaglio e/o con altre cellule infiammatorie. In particolare, ci concentreremo: 1. sul recettore attivatorio NKG2D, i cui ligandi vengono iperespressi su cellule del sistema immunitario e non, in seguito allo stress, alle infezioni, alla trasformazione neoplastica; 2. sul CD16, il recettore prototipico di attivazione delle cellule NK; 3. sul recettore inibitorio CD94/NKG2A, il cui ligando, la molecola di MHC di classe I non classica HLA-E, e' soggetta a modificazioni quantitative e qualitative in cellule infettate da diversi patogeni (Michaelsson J., et al., J. Exp. Med., 2002, 196:1403; Braud V.M., et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2002, 269:117). L'aggregazione dei recettori di membrana verra' realizzata mediante anticorpi specifici (in presenza di anticorpi secondari, od in fase solida su biglie di polistirene, o su plastica), o attraverso l'uso di cellule esprimenti il ligando. L'analisi dell'espressione verra' condotta a livello dell'mRNA (in RT-PCR); l'effetto sara' quantificato mediante real-time PCR; il trattamento con actinomicina D permettera' di comprendere il ruolo dell'attivazione trascrizionale in questo fenomeno. L'espressione dei TLR sara' saggiata mediante western blot e immunofluorescenza al FACS (sia su cellule intatte che permeabilizzate). La localizzazione intracellulare dei TLR sara' indagata mediante microscopia confocale, studiando la co-localizzazione con marcatori dei diversi compartimenti subcellulari. 2. Analisi della capacita' di ligandi per TLR3 e TLR9 di modulare la produzione di citochine e chemiochine e l'espressione di recettori di membrana coinvolti nella comunicazione cellula-cellula. I nostri risultati preliminari indicano che la stimolazione di cellule NK umane altamente purificate con ligandi di TLR3 induce rapidamente l'espressione della chemiochina CXCL10 (IP10) (Pisegna & Palmieri, manoscritto in preparazione). La capacita' di sequenze di DNA ricche in CpG non metilate (riconosciute da TLR9) di attivare direttamente le cellule NK e' ancora controversa (Hornung V., et al., J. Immunol., 2002, 168:4531; Krieg A.M., Annu. Rev. Immunol., 2002, 20:709; Iho S. et al., J. Immunol., 1999, 163:3642). Valuteremo se i ligandi specifici di TLR3 e TLR9 possono indurre o costimolare la produzione di IFNgamma and TNFalfa (indagheremo l'espressione sia della forma di membrana che di quella secreta), e di chemiochine CC (CCL3, CCL4, CCL5, CCL22) e CXC (CXCL10, CXCL8), coinvolte nel reclutamento e nell'attivazione delle cellule dell'immunita' innata. Il nostro studio valutera' se la stimolazione con i ligandi dei TLR altera l'espressione di recettori di membrana coinvolti nelle comunicazioni intercellulari con gli altri effettori della risposta immunitaria e/o con la cellula bersaglio (quali CD80, CD86, OX40L, CD69, FASL, TRAIL, ligandi di NKG2D). La stimolazione con i ligandi dei TLR sara' condotta anche in presenza delle citochine elencate nel punto 1, per valutare la possibile cooperazione fra le vie di trasduzione del segnale iniziate dai TLR e quelle governate dai recettori per citochine. La produzione di citochine e chemiochine sara' valutata a livello di mRNA (mediante RT-PCR, real-time PCR, RPA) e a livello di proteina (mediante immunofluorescenza intracellulare ed analisi citofluorimetrica, e mediante test ELISA sui sopranatanti cellulari). Il pretrattamento con cicloesimmide e actinomicina D ci permettera' di accertare se la secrezione di citochine dipende dal rilascio di un pool preformato o piuttosto dalla neosintesi. L'analisi immunocitofluorimetrica e la real-time PCR saranno impiegate per valutare la modulazione dell'espressione di recettori di membrana. La rilevanza funzionale dell'espressione di FASL e TRAIL sara' verificata in test di citotossicita' utilizzando cellule bersaglio esprimenti i ligandi specifici. Il ruolo dell'attivazione trascrizionale nella modulazione dei recettori di membrana sara' valutato mediante il pretrattamento con actinomicina D; la cicloesimmide sara' utilizzata per discernere se l'attivazione trascrizionale dipende direttamente dalle vie di segnalazione iniziate dai TLR, o piuttosto richieda la sintesi di altri mediatori. 3. Analisi delle vie di trasduzione del segnale iniziate da TLR3 e TLR9. Le vie di segnalazione regolate dai TLR sono state scarsamente studiate nelle cellule che esprimono fisiologicamente i recettori. L'attivazione di NFkappaB e delle MAPK sembrano essere eventi comuni nella trasduzione del segnale di TLR differenti. I dati ottenuti dal nostro gruppo indicano che la stimolazione con dsRNA induce l'attivazione della MAPK p38 in cellule NK umane altamente purificate (Pisegna & Palmieri, manoscritto in preparazione). Analizzeremo la capacita' dei ligandi specifici di TLR3 e TLR9 di indurre l'attivazione dei diversi membri della famiglia MAPK; lo stato di attivazione di ERK, JNK e p38 sara' valutato mediante western blot, o immunofluorescenza intracellulare ed analisi al citofluorimetro, utilizzando anticorpi specifici per la forma fosforilata delle singole chinasi, e sara' confermato mediante saggi chinasici in vitro su immunoprecipitati delle singole chinasi. L'attivazione di NFkappaB sara' valutata analizzando la traslocazione nucleare del fattore trascrizionale, la degradazione di IkappaB, e utilizzando il saggio EMSA. Studieremo inoltre la capacita' del dsRNA di promuovere l'attivazione del fattore trascrizionale IRF3, un evento indotto selettivamente dal TLR3, analizzando la sua traslocazione nucleare; il possibile ruolo delle vie regolate dalle MAPK nell'attivazione di IRF3 mediata dal TLR3 sara' valutato mediante l'uso di inibitori farmacologici specifici. Indagheremo inoltre l'attivazione TLR-mediata di tirosino-chinasi specifiche, valutando direttamente lo stato di attivazione di membri delle famiglie src e syk/Zap70, ed il ruolo di questi enzimi negli eventi distali della trasduzione del segnale mediata dai TLR (IRF3, MAPK and NFkappaB); questo punto del progetto sara' affrontato utilizzando inibitori farmacologici selettivi delle diverse tirosino-chinasi, e attraverso l'iperespressione di mutanti costitutivamente attivi o dominanti negativi delle diverse chiansi, mediante vettori retrovirali o lentivirali. Analizzeremo anche il ruolo della compartimentalizzazione dei TLR nel permettere l'avvio della trasduzione del segnale, saggiando l'attivazione di NFkappaB e MAPK in cellule trattate con agenti (clorochina, Bafilomicina A) che alterano il compartimento lisosomiale. Lo studio del ruolo dell'ambiente cellulare nella capacita' segnalatoria dei TLR sara' affrontato confrontando la capacita' dei ligandi per TLR3 e TLR9 di indurre l'attivazione di MAPK, IRF3, NFkappaB e della fosfolipasi D in macrofagi e cellule NK (in collaborazione con l'Unita' Fraziano) 4. Analisi del ruolo delle vie di segnalazione nelle funzioni modulate dai ligandi di TLR3 e TLR9. Analizzeremo il ruolo di intermedi distinti di segnalazione (NFkappaB, IRF3, MAPK) nelle funzioni attivate dai TLR (descritte nel punto 2). Interferiremo con l'attivazione delle diverse cascate di trasduzione del segnale mediante uso di inibitori farmacologici specifici per i diversi membri delle MAPK, iperesprimendo un mutante "supersuppressor" di IkappaB, o mutanti dominanti negativi di IRF3. 5. Analisi della capacita' dei ligandi per TLR3 e TLR9 di modulare la funzione citotossica delle cellule NK. Abbiamo recentemente dimostrato che la stimolazione di popolazioni altamente purificate di cellule NK umane con dsRNA aumenta significativamente sia la citotossicita' naturale, che la lisi CD16-dipendente (Pisegna & Palmieri, manoscritto in preparazione). Valuteremo la capacita' di CpG ODN di modulare la lisi di cellule bersaglio dell'attivita' NK. Utilizzeremo inoltre come bersaglio macrofagi infettati da micobatterio (in collaborazione con l'Unita' Fraziano) e saggeremo l'attivita' citotossica di popolazioni differenti di cellule NK stimolate da ligandi per TLR3 e TLR9, come modello per studiare l'attivita' antimicrobica delle cellule NK; in questo contesto, analizzeremo il ruolo dei ligandi per il recettore attivatorio NKG2D utilizzando anticorpi bloccanti. 6. Analisi della capacita' dei ligandi di TLR3 e TLR9 di modulare l'apoptosi indotta dall'attivazione in cellule NK. La capacita' del CD16 di indurre l'apoptosi in cellule NK attivate dipende principalmente dall'espressione e dalla funzione di membri della famiglia dei "recettori di morte". Valuteremo se la stimolazione con ligandi dei TLR e' in grado di modulare questo evento, e quindi modificare la sopravvivenza delle cellule NK nel sito d'infezione. Popolazioni altamente purificate di cellule NK attivate da IL-2 saranno stimolate con anticorpi anti-CD16 in presenza dei ligandi per i TLR; l'apoptosi sara' valutata mediante diverse tecniche: l'analisi al citofluorimetro sara' utilizzata per misurare la colorazione con Annessina-5-FITC e la presenza di nuclei ipodiploidi sara' quantizzata mediante colorazione con ioduro di propidio; la frammentazione del DNA sara' analizzata mediante elettroforesi su gel; la comparsa del prodotto proteolitico della caspasi 3 sara' valutato mediante western blot. Nelle stesse condizioni sperimentali, analizzeremo l'espressione di FAS/FASL, TNF e TRAIL, mediante RT-PCR ed analisi immunocitofluorimetrica; il loro stato funzionale sara' valutato mediante test di citotossicita', come descritto nel punto 2. Il progetto e' diviso in 2 Fasi: nella fase I (1-12 mesi), analizzeremo la modulazione di TLR3 e TLR9 da parte di stimoli differenti ed i meccanismi coinvolti; a livello funzionale, valuteremo la capacita' di ligandi dei TLR di modulare la produzione di citochine, l'espressione di recettori di superficie, e la funzione citotossica in popolazioni altamente purificate di cellule NK umane; saggeremo l'attivita' di membri della famiglia MAPK, e dei fattori trascrizionali NFkappaB e IRF3, e gli eventi che ne regolano l'attivazione mediata dai TLR. Nella Fase II (mesi 13-24), valuteremo la rilevanza delle diverse vie di segnalazione attivate dai TLR nelle funzioni delle cellule NK riportate nel punto 2; studieremo l'attivazione di MAPK, IRF3 e fosfolipasi D da parte di ligandi per TLR3 e TLR9 in diverse cellule dell'immunita' innata; analizzeremo se la stimolazione con ligandi di TLR3 e TLR9 altera la capacita' delle cellule NK di lisare macrofagi infettati. Infine, investigheremo la capacita' dei ligandi per TLR di modulare l'apoptosi indotta dal CD16 in cellule NK.
