RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Analisi della capacita' dei Toll-like receptors (TLR) di modulare le funzioni effettrici e regolatorie delle cellule dell'immunita' innata

Università di riferimento

Università degli Studi di PALERMO - BIOPATOLOGIA E METODOLOGIE BIOMEDICHE - PALERMO(PA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Francesco DIELI

Descrizione

Scopo del progetto di ricerca proposto è valutare il possibile ruolo svolto da TLR3 e TLR9 e dai loro ligandi, nella attivazione e nella induzione di funzioni effettrici dei linfociti T Vg9Vd2, nonchè la capacità di macrofagi o cellule dendritiche stimolati da CpG di esprimere ligandi per NKG2D ed attivare in tal modo i linfociti Vg9Vd2. Il progetto è articolato in due fasi, della durata di 12 mesi ciascuna. Fase 1 (Durata: mese 0 – mese 12) Nel corso della prima fase del progetto di ricerca ci proponiamo di raggiungere i seguenti obiettivi: 1. Valutare la espressione di TLR3 e TLR9 su differenti subset di linfociti Vg9Vd2 ottenuti dal sangue periferico; 2. Valutare la modulazione della espressione di TLR3 e TLR9 in seguito a stimolazione con fosfoantigeni o con citochine di cui è nota per la loro attività sui linfociti Vg9Vd2, quali IL-2, IL-12, IL-15 e TNFa; 3. Valutare gli eventuali effetti indotti dalla stimolazione dei linfociti Vg9Vd2 da parte di ligandi di TLR3 e TLR9, cioè dsRNA e CpG, rispettivamente, con particolare riferimento alla proliferazione, produzione di citochine e chemiochine, attività citotossica ed alla capacità di tali composti di stimolare la differenziazione dei linfociti Vg9Vd2 memory a cellule effettrici e terminalmente differenziate. Da un punto di vista metodologico, linfociti T Vg9Vd2 verranno isolati da cellule mononucleate da sangue periferico (PBMC) mediante anticorpi monoclonali anti-Vd2 coniugati a biglie immunomagnetiche e verranno successivamente separati mediante Cell Sorter in 4 subsets (naive, memory, effettori e terminalmente differenziate) in seguito a marcatura con anticorpi monoclonali anti-CD27 ed anti-CD45RA coniugati con fluorocromi. Questa procedura di separazione in due fasi (immunomagnetica prima e citofluorimetrica dopo) è stata da noi ampiamente collaudata e si è dimostrata nettamente superiore ad una separazione citofluorimetrica dopo marcatura con tre anticorpi monoclonali (anti-Vd2, anti-CD27 ed anti-CD45RA), soprattutto perché non influenza la successiva analisi funzionale dei subset di linfociti Vg9Vd2 (Dieli et al., J. Exp. Med. 198: 391-397; 2003). L’espressione di TLR3 e TLR9 sui differenti subsets di linfociti Vg9Vd2 verrà inizialmente valutata mediante RT-PCR su mRNA estratto da tali cellule, secondo la metodica descritta da Hornung et al. (J. Immunol. 168: 4531-4537; 2002), amplificando il cDNA ottenuto con primers specifici per TLR3 (Codice di accesso GeneBank NM_003265, sequenza 1505–1717) e TLR9 (Codice di accesso GeneBank AF245704, sequenza 2741–2941). I risultati ottenuti mediante RT-PCR verranno eventualmente confermati ed ampliati mediante l’uso di anticorpi monoclonali anti-TLR3 e TLR9, coniugati con fluorocromi, in modo da valutare anche la localizzazione dei due recettori (membrana, citoplasma). Questa ultima fase del progetto verrà svolta in collaborazione con la Unità della Prof.ssa Palmieri). L’espressione di TLR3 e TLR9 verrà anche valutata in seguito ad incubazione di linfociti Vg9Vd2, o loro subsets, con fosfoantigeni (BrHPP, alla concentrazione finale di 10 e 100 nM) o con citochine già note in letteratura per la capacità a stimolare i linfociti Vg9Vd2, quali IL-2, IL-12, IL-15 e TNFa (tutte alla concentrazione finale di 10 ng/ml). Allo scopo di valutare gli effetti dei ligandi di TLR3 e TLR9 sui linfociti Vg9Vd2, popolazioni purificate da PBMC verranno incubate con dsRNA o poli I:C (TLR3) o con le seguenti differenti preparazioni di CpG (TLR9): ODN 2006 5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’ (Bernasconi et al., Science 298: 2199-2202; 2002); ODN 2216, 5'-ggGGGACGATCGTCgggggG-3' (Hornung et al., J. Immunol. 168: 4531-4537; 2002); ODN 5’ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’ (Auricchio et al., Cell. Micriobiol. 5: 913-920; 2003) alla concentrazione di 2.5 µg/ml. I corrispondenti GC ODN saranno utilizzati come controllo negativo. La proliferazione dei linfociti Vg9Vd2 verrà valutata mediante due tecniche citofluorimetriche, diluizione di CSFE e marcatura intracitoplasmatica con anticorpi anti-Ki67. La produzione di citochine (IFNg e TNFa) e chemochine (MIP-1a e MIP-1b) nei supernatanti verrà valutata mediante ELISA, utilizzando kit commerciali. L’attività citotossica verrà valutata indirettamente analizzando l’espressione intracitoplasmatica di perforina e granulisina mediante anticorpi monoclonali specifici, e direttamente mediante studio della citotossicità verso cellule Daudi. L’ attività antimicrobica svolta da linfociti Vg9Vd2 preventivamente stimolati con CpG e/o con poli I:C, in un modello di cocoltura con macrofagi infettati con Mycobacterium tuberculosis verrà valutata dalla Unità del Dott. Fraziano). Infine, la capacità dei ligandi di TLR3 e TLR9 di indurre differenziazione di linfociti Vg9Vd2 di tipo memory a cellule effettrici e terminalmente differenziate, verrà valutata incubando linfociti Vg9Vd2 memory, separati come precedentemente descritto, con tali ligandi, in presenza od assenza di IL-15, per 5-7 giorni, e valutando la popolazione generata alla fine della cultura sia per quanto concerne il fenotipo di membrana, che le capacità effettrici (produzione di citochine e citotossicità). I risultati attesi alla fine della prima fase di questo progetto di ricerca consistono nella valutazione dell’ espressione di TLR3 e TLR9, costitutiva o indotta dall’ antigene e/o da citochine, su differenti subset di linfociti Vg9Vd2 e nella analisi degli effetti dei ligandi di TLR3 e TLR9 sulla attivazione, attività funzionale e differenziazione di tali cellule. Fase 2 (Durata: mese 12 – mese 24) Nel corso della seconda fase del progetto di ricerca ci proponiamo di raggiungere i seguenti obiettivi: 1. Valutare la capacità di macrofagi o cellule dendritiche stimolati da CpG di esprimere ligandi per NKG2D ed attivare in tal modo i linfociti Vg9Vd2; 2. Valutare le differenti funzioni effettrici e l’interazione dei linfociti Vg9Vd2 con macrofagi e cellule NK. Da un punto di vista metodologico, i macrofagi verranno ottenuti da PBMC mediate separazione con anticorpi anti-CD14 coniugati a biglie immunomagnetiche, mentre le cellule dendritiche verranno ottenute secondo una procedura standard, incubando i macrofagi, separati come prima descritto, con IL-4 e GM-CSF. I macrofagi e le cellule dendritiche verranno incubate con CpG, secondo le modalità già descritte nella Fase I, o, come controllo positivo, con Mycobacterium tuberculosis, che è noto indurre l’espressione di MICA in macrofagi e cellule dendritiche (Das et al., Immunity 15: 83-93; 2000). L’espressione di MICA verrà valutata mediante RT-PCR e mediante citofluorimetria con anticorpi monoclonali specifici. La capacità di macrofagi e cellule dendritiche stimolati da CpG o micobatteri, di attivare i linfociti Vg9Vd2 verrà analizzata mediante cocultura in vitro, valutando diversi parametri. La proliferazione dei linfociti Vg9Vd2 verrà valutata mediante due tecniche citofluorimetriche, diluizione di CSFE e marcatura intracitoplasmatica con anticorpi anti-Ki67. La produzione di citochine (IFNg e TNFa) e chemochine (MIP-1a e MIP-1b) nei supernatanti verrà valutata mediante ELISA, utilizzando kit commerciali. L’attività citotossica verrà valutata indirettamente analizzando l’espressione intracitoplasmatica di perforina e granulisina mediante anticorpi monoclonali specifici, e direttamente mediante studio della citotossicità verso cellule Daudi. In tutti gli esperimenti, verranno utilizzati anticorpi monoclonali anti-MICA ed anti-NKG2D, allo scopo di determinare il reale contributo dato dalla interazione tra queste molecole nella attivazione e generazione di funzioni effettrici dei linfociti Vg9Vd2. La interazione tra linfociti Vg9Vd2, attivati direttamente o indirettamente (cioè da cellule dendritiche e macrofagi stimolati da CpG) da CpG, con macrofagi e cellule NK, verrà studiata in collaborazione con le altre 2 Unità di questo progetto, valutando, in sistemi di cocultura, la capacità dei linfociti Vg9Vd2 di indurre secrezione di citochine ed attività citotossica e microbicida a carico dei macrofagi e dei linfociti NK. I meccanismi responsabili di tale eventuale interazione verranno inizialmente studiati mediante sistemi di cultura in transwell, in modo da evidenziare il potenziale ruolo svolto da mediatori solubili o dalla necessità di un contatto cellula-cellula e, quindi, del potenziale coinvolgimento di ligandi e recettori di membrana. In entrambi i casi, si cercherà di identificare le molecole, solubili e/o di membrana, ed i recettori coinvolti, utilizzando anticorpi monoclonali neutralizzanti specifici per le chemiochine e le citochine prodotte dai linfociti Vg9Vd2. o anticorpi monoclonali diretti verso alcune delle note molecole di membrana espresse sia dai linfociti Vg9Vd2, che da macrofagi e linfociti NK, e di cui già si conosce un potenziale ruolo nei fenomeni di cooperazione e di attivazione cellulare. I risultati attesi alla fine della seconda fase di questo progetto di ricerca, consistono nella valutazione della capacità di ligandi di TLR9 di attivare indirettamente i linfociti Vg9Vd2, vale a dire, mediante la induzione in macrofagi e cellule dendritiche di molecole stimolatorie o costimolatorie per questo subset cellulare, nonché valutare le differenti funzioni effettrici e l’interazione dei linfociti Vg9Vd2 con macrofagi e cellule NK.