Bibliografia
1. Dabbagh K, Lewis DB. Toll-like receptors and T-helper-1/T-helper-2 responses. Curr Opin Infect Dis. 2003 Jun;16(3):199-204.
2. Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 2003;21:335-76.
3. Cella M., Salio M., Sakakibara Y., Langen H., Julkunen I., Lanzavecchia A. Maturation, activation and protection of dendritic cells induced by double stranded RNA. J. Exp. Med. 1999; 189: 821-9
4. Hacker H, Mischak H, Hacker G, Eser S, Prenzel N, Ullrich A, Wagner H. Cell type-specific activation of mitogen-activated protein kinases by CpG-DNA controls interleukin-12 release from antigen-presenting cells. EMBO J. 1999 Dec 15;18(24):6973-82.
5. Hancock GE, Heers KM, Pryharski KS, Smith JD, Tiberio Adjuvants recognized by toll-like receptors inhibit the induction of polarized type 2 T cell responses by natural attachment (G) protein of respiratory syncytial virus. Vaccine. 2003 Oct 1;21(27-30):4348-58
6. Dumais N, Patrick A, Moss RB, Davis HL, Rosenthal KL. Mucosal immunization with inactivated human immunodeficiency virus plus CpG oligodeoxynucleotides induces genital immune responses and protection against intravaginal challenge. J Infect Dis. 2002;186:1098-1105
7. Gallichan WS, Woolstencroft RN, Guarasci T, McCluskie MJ, Davis HL, Rosenthal KL. Intranasal immunization with CpG oligodeoxynucleotides as an adjuvant dramatically increases IgA and protection against herpes simplex virus-2 in the genital tract. J Immunol. 2001;166: 3451-7
8. Juffermans NP, Leemans JC, Florquin S, Verbon A, Kolk AH, Speelman P, van Deventer SJ, van der Poll T. CpG oligodeoxynucleotides enhance host defense during murine tuberculosis. Infect Immun. 2002 Jan;70(1):147-52.
9. Ghosh DK, Misukonis MA, Reich C, Pisetsky DS, Weinberg JB. Host response to infection: the role of CpG DNA in induction of cyclooxygenase 2 and nitric oxide synthase 2 in murine macrophages. Infect Immun. 2001; 69:7703-10.
10. Krieg AM, Love-Homan L, Yi AK, Harty JT. CpG DNA induces sustained IL-12 expression in vivo and resistance to Listeria monocytogenes challenge. Immunol. 1998 Sep 1;161(5):2428-34.
11. Hayashi T, Rao SP, Takabayashi K, Van Ulden JH, Kornbluth RS, Baird SM et al. (2001) Enhancement of innate immunity against Mycobacterium avium infection by immunostimulatory DNA is mediated by Indoleamine 2,3-dioxygenase. Infect. Immun. 69:6156-6164.
12. Auricchio G., Garg S.K., Martino A., Volpe E., Ciaramella A., De Vito P., Baldini P.M., Colizzi V., Fraziano M. Role of macrophage phospholipase D in natural and CpG-induced antimycobacterial activity. Cell. Microbiol., 2003; 5: 913-20.
13. Kusner DJ, Adams J. ATP-induced killing of virulent Mycobacterium tuberculosis within human macrophages requires phospholipase D. J Immunol 2000; 164:379-388.
14. Garg SK., Volpe E., Calmieri G., Mattei M., Galati D., Martino A., Piccioni MS., Valente E., Bonanno E., De Vito P., Baldini P.M., Spagnoli L.G., Colizzi V., Fraziano M. Sphingosine 1-Phosphate induces antimicrobial activity both in vitro and in vivo. J. Infect. Dis, 2004. in stampa
15. Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immunol 2001; 19:93-129.
16. Thoma-Uszynski S, Stenger S, Takeuchi O, Ochoa MT, Engele M, Sieling PA, Barnes PF, Rollinghoff M, Bolcskei PL, Wagner M, Akira S, Norgard MV, Belisle JT, Godowski PJ, Bloom BR, Modlin RL. Induction of direct antimicrobial activity through mammalian toll-like receptors. Science. 2001; 291:1544-7.
17. Mayorga LS, Colombo MI, Lennartz M, et al. Inhibition of endosome fusion by phospholipase A2 (PLA2) inhibitors points to a role for PLA2 in endocytosis. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:10255-9.
18. Baldini PM, De Vito P, Martino A, Fraziano M, Grimaldi C, Luly P, Zalfa F and Colizzi V. Effect of atrial natriuretic peptide on human monocytes and macrophages: a role of intracellular ph on reactive oxygen species production through the phospholipase involvement. J. Leuk. Biol. 2003; 73: 502-510
19. Dieli F, Troye-Blomberg M, Ivanyi J, Fournie JJ, Bonneville M, Peyrat MA, Sireci G, Salerno A. Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes reduce the viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 30: 1512-1519; 2000.
20. Lennartz MR. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis.
Int J Biochem Cell Biol. 1999;31:415-30.
21. Desjardins M, Huber LA, Parton RG, Griffiths G. Biogenesis of phagolysosomes proceeds through a sequential series of interactions with the endocytic apparatus. J. Cell. Biol. 1994; 124: 677-688
22. Ciaramella A, Cavone A, Santucci MB, Amicosante M, Martino A, Auricchio G, Pucillo LP, Colizzi V, Fraziano M. Pro-inflammatory cytokines in the course of Mycobacterium tuberculosis-induced apoptosis in monocytes/macrophages J. Infect. Dis. 2002; 186: 1277–82
23. Disegna S, Zingani A, Dirozzi G, Cinque B, Cifone MG, Morrone S, Piccoli M, Frati L, Calmieri P, Santoni A. Src-Dependent Syk Activation Controls CD69-Mediated Signaling and Function on Human NK Cells. J. Immunol. 2002; 169: 68–74.
Programma di ricerca
Analisi della capacita' dei Toll-like receptors (TLR) di modulare le funzioni effettrici e regolatorie delle cellule dell'immunita' innata
Università di riferimento
Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata" -
BIOLOGIA - ROMA(RM)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Maurizio FRAZIANO
Descrizione
Poiché il TLR3 ed il TLR9 sono recettori intracitoplasmatici per acidi nucleici che svolgono una azione di immunosorveglianza nei confronti di patogeni intracellulari, è plausibile ipotizzare che le risposte mediate dal TLR3 possano, almeno parzialmente, sovrapporsi a quelle mediate dal TLR9 almeno in termini di induzione di risposta antimicrobica. Sulla base di queste premesse, lo scopo del presente programma di ricerca è di studiare il ruolo del TLR3 e del TLR9 nell'indurre attività antimicobatterica nel macrofago, con particolare riferimento ai meccanismi molecolari coinvolti nella maturazione del fagolisosoma. A questo riguardo, il presente programma di ricerca si articola in due fasi principali di 12 mesi ciascuna. Fase 1 (mese 0 – mese 12) All'interno di questa fase, ci si propone di raggiungere i seguenti obiettivi: 1. Valutare se il poli(I:C) analogamente a quanto avviene per altri ligandi di TLRs è in grado di indurre attività microbicida in macrofagi umani. 2. Analizzare il coinvolgimento di alcune fosfolipasi macrofagiche nell'attività antimicobatterica indotta sia dalle sequenze di tipo CpG che, eventualmente, da poli(I:C). In particolare, allo scopo di valutare se un ligando classico del TLR3 quale il poli(I:C) possa indurre meccanismi microbicidi nel macrofago, analogamente a quanto avviene per il le coppie ligando recettore CpG/TLR9 e lipoproteina 19-kDa/TLR2, cellule THP-1, indotte a differenziare tramite 72 ore di stimolazione con 20 ng/ml di PMA, verranno infettate con BCG o MTB alla MOI di 1 per 3 ore e stimolate con poli(I:C) alle concentrazioni di 10, 50, 200 ug/ml. Dopo 1, 3 e 5 giorni verrà valutato il numero di micobatteri intracellulari mediante saggi di CFU, come precedentemente descritto (12, 14). Allo scopo di studiare il coinvolgimento della fosfolipasi D macrofagica nell'eventuale attività antimicrobica indotta da poli(I:C), verranno effettuati degli esperimenti in cromatografia su strato sottile attraverso i quali monitorare l'attività enzimatica (12, 14). Infine, poiché l'attività della fosfolipasi D è specificatamente inibita dalla presenza di alcoli primari, allo scopo di verificarne il coinvolgimento nei processi antimicrobici eventualmente indotti dalle sequenze poli(I:C), i macrofagi infettati con MTB e stimolati con poli(I:C) verranno contemporaneamente incubati in presenza di un alcol primario (butanolo) o secondario (iso-butanolo, da usare come controllo), ed il numero delle colonie intracellulari monitorate come precedentemente descritto (14). Poiché l'acido arachidonico prodotto in seguito ad attivazione della fosfolipasi A2 (PLA2) è direttamente coinvolto nella maturazione fagolisosomale e poiché la PLA2 può essere attivata dall'acido fosfatidico (17), prodotto in corso di attivazione della fosfolipasi D indotta da CpG, in questa parte del presente programma di ricerca verrà valutato l'eventuale ruolo della PLA2 nel controllo della crescita intracellulare di MTB indotta da CpG e/o poli(I:C). A tale scopo verrà preliminarmente valutata l'attività della PLA2 su cellule THP1 differenziate ed infettate con MTB alla MOI di 1 in seguito a stimolazione con sequenze CpG (ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC) (12) e/o poli(I:C), tramite fluorimetria (Genius-FL, TECAN) usando il substrato fluorogenico PED-6 (Molecular Probe). Le sequenze di DNA CpG, o GpC come controllo, verranno utilizzate alle concentrazioni di 0.2, 2 e 20 uM, mentre il poli(I:C) verrà utilizzato alle concentrazioni di 10, 50 e 200 ug/ml. L'attività enzimatica sarà valutata a 5, 15, 30, 60 e 90 minuti dalla stimolazione. Similmente, sarà valutata l'attività della PC-PLC (phosphatidilcoline dependent phospholipase C) tramite kit disponibile commercialmente (Amplex Red Phosphatidylcholine-Specific Phospholipase C Assay Kit, fornito dalla Molecular Probe). Allo scopo di valutare il contributo della PC-PLC e della PLA2 al controllo della crescita intracellulare micobatterica indotto da CpG e/o poli(I:C), verranno utilizzati i seguenti inibitori enzimatici specifici: il D-609 (potassio triciclo-(5,2,1,0)-decil-[9(8)-xantogenato], fornito dalla Molecular Probe) per la PC-PLC, e l' AACOCF3 (arachidonyl trifluormetil chetone, fornito dalla Biomol) per la PLA2. In particolare, cellule della linea THP1, indotte a differenziare tramite 72 ore di incubazione in presenza di 20 ng/ml di PMA, ed infettate con MTB alla MOI di 1, verranno stimolate con CpG e/o poli(I:C) in presenza di diverse concentrazioni di inibitore (0.5, 5 e 50 ug/ml per l'inibitore della PC-PLC e 0.5, 5 e 50 microM per l'inibitore della PLA2) ed incubate per 1, 3 e 5 giorni. A tali tempi sarà effettuato il saggio delle unità formanti colonie. Poiché la produzione di acido fosfatidico è associata all'attivazione della NADPH ossidasi (18) e poiche tale enzima è coinvolto, attraverso la generazione di ROI, nei processi microbicidi macrofagici, il ruolo di questo enzima nel controllo della crescita intracellulare di MTB indotto da CpG e/o poli(I:C) verrà valutato effettuando esperimenti, analoghi ai precedenti ma in presenza dell'inibitore DPI (diphenyleneiodonium, fornito dalla Biomol) specifico per la NADPH ossidasi, usato alle concentrazioni di 0.01, 0.1, 1 mM. All'interno di questa fase, verrà valutata, in collaborazione con la unità operativa # 2, l'attività antimicobatterica esercitata da linee cellulari T gamma delta, fornite dalla stessa unità operativa e generate secondo protocolli sperimentali già descritti (19). In particolare, le cellule effettrici, stimolate con CpG e/o poli(I:C) alle concentrazioni sopra descritte, verranno coltivate in presenza di macrofagi infettati con MTB alla MOI di 1 a diversi rapporti effettori/target. Dopo 1, 3 e 5 giorni verranno eseguiti i saggi di CFU per la conta dei micobatteri intracellulari. Fase 2 (mese 13 – mese 24) Allo scopo di stabilire i meccanismi attraverso i quali sequenze di tipo CpG e/o poli(I:C) inducono attività antimicobatterica nel macrofago, nella seconda fase del presente programma di ricerca sarà analizzato il ruolo svolto dalla maturazione del fagolisosoma attraverso approcci di western blotting e microscopia confocale. Inoltre, poiché l'attivazione della fosfolipasi D è spesso associata all'attivazione di altre fosfolipasi, quali la fosfolipasi C e la fosfolipasi A2 (20), verrà studiato il loro coinvolgimento nella biogenesi del fagolisosoma. L'analisi della biogenesi del fagolisosoma tramite Western Blotting verrà eseguita dopo separazione dei fagosomi dagli altri organelli cellulari tramite ultracentrifugazione su gradiente di sucrosio come descritto precedentemente (21). In particolare, cellule THP-1, indotte a differenziare tramite 72 ore di stimolazione con 20 ng/ml di PMA, verranno infettate con BCG o MTB alla MOI di 1 per 3 ore e trattate con 2 uM di CpG o con la dose ottimale di poli(I:C), determinata nella fase precedente, per 24 ore. Le cellule verranno quindi lavate con PBS freddo, e risospese in 500 uL di un tampone di omogenizzazione (Sucrosio 250 mM, imidazolo 3 mM, pH 7.4) e omogenate delicatamente tramite omogenizzatori Dounce in ghiaccio. Le cellule intatte verranno rimosse tramite centrifugazione a 1200 RPM per 5 min a 4°C, mentre il sopranatante contenente i fagosomi verrà recuperato e portato ad una concentrazione di sucrosio al 40%. 1 ml di questa sospensione verrà stratificata su un gradiente di sucrosio al 62%. Successivamente, verranno sequenzialmente aggiunte 2 ml di sucrosio al 35%, 2 ml di sucrosio al 25% e 2 ml di sucrosio al 10%. La sospensione verrà ultracentrifugata a 100.000 g per 1 ora. 1 ml della frazione contenente i fagosomi verranno raccolti dall'interfaccia tra le concentrazioni 10% e 25% di sucrosio. I fagosomi verranno risospesi in 9 ml di PBS e centrifugati a 40000 g per 30 minuti. Il pellet contenente i fagosomi sarà denaturato al calore in SDS-PAGE, le proteine separate tramite elettroforesi e sottoposte a Western Blotting come precedentemente descritto (22). Il trasferimento delle proteine da gel al filtro di nitrocellulosa avverrà al voltaggio costante di 15 V a tempi differenti a seconda del peso molecolare della proteina di interesse (Semidry System, Bio-rad). I filtri con le proteine così trasferite verranno quindi, analizzati tramite Western Blotting, utilizzando anticorpi anti- LAMP-1, anti-Cathepsin D, anti-CD63 (marcatori endosomali tardivi), anti recettore per la Trasferrina ed anti-Rab-5 (marcatori endosomali precoci) (BD Transduction Laboratories). L'analisi della maturazione del fagolisosoma, effettuata tramite microscopia confocale, avverrà utilizzando un microscopio LEICA TCS SP2 equipaggiato con un laser Ar 100 mW con emissione a 457 nm, 476 nm, 488 nm e 514 nm, e da due laser HeNe con linee di emissione a 543 e 633 nm. In particolare, cellule THP-1, indotte a differenziare tramite 72 ore di stimolazione con PMA 20 ng/ml, verranno infettate con BCG o MTB alla MOI di 1 per 3 ore e trattate con 2 uM di CpG o con la dose ottimale di poli(I:C), determinata nella fase precedente, per 24 ore. La preparazione dei vetrini sarà eseguita secondo un protocollo sperimentale precedentemente descritto (14). L'analisi del grado di maturazione dei fagosomi contenenti MTB verrà eseguita valutando la colocalizzazione dei bacilli in seguito a marcatura dei micobatteri con auramina e dei lisosomi con il colorante acidofilo Lysotraker Red (Molecular Probes, NL). In aggiunta, allo scopo di valutare la progressione della maturazione fagolisosomale verranno utilizzati anticorpi monoclonali anti-LAMP-1, anti-Catepsina D, anti-CD63 (marcatori endosomali tardivi) anti-recettore per la transferrina ed anti-Rab-5 (marcatori endosomali precoci) (disponibili dalla BD Transduction laboratories). I risultati verranno espressi come numero dei bacilli che colocalizzano con lo specifico marcatore, contando più di 150 bacilli da almeno 60 macrofagi per campione, come descritto (14). Infine, allo scopo di valutare il coinvolgimento delle fosfolipasi D, C e A2 nella biogenesi del fagolisosoma, gli esperimenti sopra descritti verranno eseguiti in presenza o assenza di inibitori enzimatici specifici, come descritto nella fase precedente. All'interno di questa fase, si valuterà, in collaborazione con la unità operativa #1, l'attività antimicobatterica esercitata da linee cellulari NK, fornite dalla stessa unità operativa e generate secondo protocolli sperimentali già descritti (17). In particolare, le cellule effettrici, stimolate con CpG e/o poli(I:C) alle concentrazioni sopra descritte, verranno coltivate in presenza di macrofagi infettati con MTB alla MOI di 1 a diversi rapporti effettori/target. Dopo 1, 3 e 5 giorni verranno eseguiti i saggi di CFU per la conta dei micobatteri intracellulari.
