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Nell'ambito del programma di ricerca interuniversitario, l'Unità di Ricerca (UR) di Palermo avrà il compito di: · validare un protocollo diagnostico multidisciplinare per i neonati con genitali ambigui, identificando criteri modalità e tempistica per le valutazioni clinica ormonale e genica, al fine di definire un percorso condiviso per un corretto e precoce inquadramento diagnostico; · partecipare al reclutamento della casistica, con particolare riferimento ai neonati con genitali ambigui; · definire i parametri clinici ed ormonali dei pazienti reclutati; · eseguire le necessarie indagini citogenetiche (cariotipo standard, cariotipo ad alta risoluzione, Fluorescent In Situ Hybridization); · identificare le principali alterazioni citogenetiche più frequentemente responsabili di disordini della differenziazione sessuale; · preparare i campioni di DNA da sottoporre alla valutazione genetica; · effettuare lo studio dei principali geni responsabili di disordini della differenziazione sessuale, con particolare riferimento ai geni SRY e CYP21; · identificare le principali mutazioni geniche più frequentemente responsabili di disordini della differenziazione sessuale; · valutare la correlazione tra il dato clinico-ormonale e l'alterazione genotipica per ciascun paziente; · valutare lo sviluppo psicosessuale dei pazienti con genitali ambigui in relazione alla etiologia ed alla gestione clinica e terapeutica eseguita. Per raggiungere tali obiettivi, l'UR identificherà quattro aree di lavoro: a) attività clinica, per il reclutamento dei pazienti, la loro valutazione clinica, la diagnostica strumentale ed i dosaggi ormonali, secondo modalità tempi e criteri condivisi con le altre UR dello studio multicentrico; b) laboratorio di citogenetica, per l'analisi citogenetica dei pazienti effettuando la valutazione del cariotipo standard e ad alta risoluzione e qualora necessario la FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) attraverso l'uso di sonde specifiche per le diverse regioni cromosomiche per la più precisa definizione di microaberrazioni o traslocazioni cromosomiche; c) laboratorio di genetica molecolare, per la identificazione di eventuali mutazioni nei geni coinvolti nella differenziazione sessuale, con particolare riferimento all'SRY e al CYP21, tramite amplificazione attraverso PCR dell'intera regione codificante e sequenza diretta con sequenziatore automatico; d) elaborazione informatica dei dati, per la stesura di una scheda informatizzata da condividere con le altre Unità di Ricerca per la raccolta dei dati clinici e di laboratorio, per la valutazione globale della casistica e di eventuali correlazioni genotipo-fenotipo, per l'analisi statistica dei dati raccolti ed il loro confronto con altre esperienze in letteratura internazionale. I neonati con genitali ambigui verranno inquadrati in relazione alla presenza di: · ipospadia (ad eccezione di quella balanica isolata); · micropene (lunghezza del pene < 2.5 cm nel neonato a termine, < 2 cm nel neonato pretermine < 34 w di età gestazionale, < 1.5 cm nel neonato pretermine < 30 w di età gestazionale); · clitoridomegalia (lunghezza del clitoride > 1 cm); · criptorchidismo bilaterale; · ernia inguinale monolaterale o bilaterale con genitali esterni di tipo femminile; · assetto citogenetico prenatale discordante con il fenotipo. Tutti i pazienti reclutati saranno avviati ad un iter diagnostico che prevede: A) valutazione clinica § anamnesi familiare e gravidica - antecedenti nella famiglia - ricorrenza nella fratria - consanguineità dei genitori - difficoltà di procreazione spontanea e/o nascita con tecniche di procreazione assistita - assunzione di farmaci in gravidanza - tipo e ambiente di lavoro della madre § analisi del fenotipo - peso, lunghezza circonferenza cranica - età gestazionale - descrizione dei genitali (micropene, clitoridomegalia, numero e posizione del meato uretrale, descrizione dello scroto, presenza ed eventuale posizione di formazioni palpabili nel canale inguinale, documentazione fotografica dei genitali) - descrizione del fenotipo generale (con particolare attenzione alla eventuale presenza di iperpigmentazione cutanea, malformazioni extragenitali, ritardo di crescita intrauterino, ipotonia) - descrizione ed istologia della placenta B) indagini di laboratorio e strumentali § routine (elettroliti sierici, glicemia, pressione arteriosa) § cariotipo § ecografia pelvica § dosaggi ormonali a 24-48 ore di vita (LH, FSH, Androstenedione, Testosterone, Diidrotestosterone) § dosaggi ormonali a 4 e a 9-12 giorni di vita (ACTH, Progesterone, 17-idrossiprogesterone, 17-idrossipregnenolone, Deidroepiandrosterone, Androstenedione) § MIF § 7-deidrocolesterolo plasmatico (se IUGR e/o dismorfie) § analisi genetico molecolari selezionate sulla base del quadro clinico e laboratoristico già acquisito C) follow-up clinico e psicosessuale dei pazienti con pregressa diagnosi di genitali ambigui per valutare lo sviluppo dell'identità di genere § diagnosi ed attribuzione di sesso § eventuale riattribuzione di sesso § interventi chirurgici correttivi ed eventuali complicanze § valutazione clinica con particolare riferimento all'aspetto estetico e funzionale dei genitali esterni § valutazione psicologica nei vari momenti della crescita, anche attraverso la somministrazione di questionari appositamente predisposti § situazione familiare e integrazione scolastica Il Dipartimento Materno Infantile (DMI), in cui opera la nostra UR, ha una lunga e provata esperienza nello studio delle patologie della differenziazione sessuale e costituisce uno dei centri di riferimento italiani, dove confluiscono anche pazienti provenienti da altre sedi. Presso il DMI nascono ogni anno oltre 3.000 neonati con una alta incidenza di patologia genetica e patologia malformativa congenita in quanto molte gravidanze a rischio vengono centralizzate presso questa sede. Presso il DMI infatti è un centro di III livello con Terapia Intensiva Neonatale, Pediatria, Ostetricia e Ginecologia, Chirurgia Pediatrica e numerosi servizi tra i quali il Laboratorio di Citogenetica, il Laboratorio di Genetica Molecolare e la Diagnosi Prenatale. Il DMI è inoltre Centro di Riferimento Regionale per le Patologie Cromosomiche e Genetiche e sede del Registro "ISMAC" delle Malformazioni Congenite in Sicilia Occidentale. Molti piccoli pazienti nati o assistiti presso altri presidi sanitari della Regione Sicilia vengono, quindi, inviati presso il DMI per la diagnosi e cura di patologie genetiche e malformative, tra le quali in particolare i disordini della differenziazione sessuale. Presso il DMI, infatti, opera una equipe multidisciplinare che comprende oltre alla figura del neonatologo e del pediatra endocrinologo, lo psicologo, il chirurgo pediatra, il genetista, il biologo molecolare, il radiologo, il ginecologo, l'andrologo. Le attività non di esclusiva pertinenza di questa UR saranno svolte utilizzando una metodologia in rete informatica costituendo una mailing list che permetta di garantire una facile, economica e rapida condivisione delle informazioni. Nel corso dei primi 6 mesi si procederà alla stesura della scheda informatizzata da mettere a disposizione di tutte le UR che parteciperanno al reclutamento dei pazienti. Contestualmente verrà proposto ed approvato, di comune accordo con le altre UR, un percorso diagnostico multidisciplinare per il corretto e rapido inquadramento della patologia responsabile. Nel secondo semestre inizierà il reclutamento dei pazienti e contestualmente la compilazione per ciascun paziente reclutato della scheda informatizzata con i dati clinici e laboratoristici. Previo consenso informato, per ciascun paziente verrà inoltre prelevato un campione di sangue in eparina da avviare per le colture cellulari e le indagini citogenetiche e un campione di sangue in EDTA da avviare per l'estrazione ed amplificazione del DNA e le indagini genico molecolari. Tali campioni verranno raccolti e conservati da questa UR che provvederà in urgenza a tutte le valutazioni necessarie per un rapido e corretto inquadramento diagnostico e quindi per l'attribuzione del sesso al paziente. Ulteriori indagini utili al fine di un più ampio approfondimento scientifico (es. sequenziazione del gene per ricerca di mutazioni e studio di polimorfismi genici) verranno effettuate successivamente nel corso dello studio. Un'aliquota di DNA estratto verrà inviata all'UR della Prof.ssa Camerino per l'analisi molecolare dei geni coinvolti nel processo di formazione e determinazione sessuale della gonade (DAX1, WNT4 e DMRT1, DHH, LHX9, …) in base alla valutazione fenotipica e clinica di ciascun paziente. Nel terzo semestre dello studio proseguirà e si completerà il reclutamento dei pazienti e si avvieranno le indagini di genetica molecolare più complesse e non gravate da carattere di urgenza. Nell'ultimo semestre dello studio verranno completate le indagini di genetica molecolare e si procederà alla analisi globale dei dati ed alla loro valutazione statistica verificando possibili correlazioni genotipo-fenotipo. L'UR di Palermo darà luogo a riunioni con cadenza trimestrale di tutto il personale che partecipa allo studio nelle quattro aree di lavoro, al fine di verificare il corretto avanzamento dei lavori secondo il programma calendarizzato e di adottare le eventuali modifiche che dovessero rendersi necessarie. L'UR di Palermo, inoltre, si confronterà con le altre UR che partecipano allo studio interuniveristario con cadenza semestrale, in modo da coordinare i diversi compiti di ciascuna per assicurare la corretta metodologia di lavoro ed il conseguimento degli obiettivi comuni prefissati. I risultati dello studio verranno messi a disposizione della comunità scientifica sia in occasione di Congressi e Convegni che attraverso la pubblicazione su riviste scientifiche specializzate a diffusione internazionale.
