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Negli ultimi anni è stato isolato un certo numero di geni coinvolti nella determinazione del sesso gonadico e nella differenziazione del testicolo. Il nostro gruppo in particolare ha partecipato all'isolamento ed alla caratterizzazione dei geni DAX1 e DMRT1. Intendiamo cercare mutazioni nei geni chiave per la determinazione e differenziazione del sesso gonadico nei pazienti intersessuali oggetto della ricerca. Naturalmente, non tutti i pazienti verranno analizzati per tutti i geni noti: a seconda del fenotipo verrà valutato, di caso in caso, quale siano i geni candidati più adatti. In particolare nei casi di inversione del sesso familiare, verrà effettuata una analisi di linkage per escludere loci noti. Il sequenziamento del genoma umano, la caratterizzazione di trascritti e pattern di espressione e la produzione di modelli animali permettono di identificare "in silico" nuovi geni candidati. Intendiamo analizzare il DNA dei pazienti intersessuali per cercare mutazioni in nuovi geni potenzialmente coinvolti nella determinazione del sesso gonadico e nella differenziazione del testicolo. Abbiamo già iniziato lo screening di una parte dei pazienti già presenti nel nostro laboratorio per due geni: Il gene Desert Hedgehog (DHH), è coinvolto nella formazione dei nervi periferici e nella differenziazione delle cellule del Leydig e delle cellule mioidi del testicolo (Bitgood et al. 1996; Parmantier et al. 1999; Yaho et al., 2002). Recentemente, una mutazione omozigote in DHH è stata evidenziata in una paziente 46,XY co disgenesia gonadica parziale ed una forma particolare di polineuropatia periferica (Umehara et al., 2000). E' possibile che mutazioni in questo gene possano causare forme di intersessualità di tipo XY senza neuropatia periferica associata. Il secondo gene per cui stiamo effettuando ricerche è il gene LHX9, un fattore di trascrizione con domini LIM e homeobox. E' stato dimostrato che l'inattivazione dell'omologo murino Lhx9 causa agenesia gonadica isolata. Intendiamo inoltre identificarenuovi geni coinvolti nella determinazione del sesso gonadico e nella differenziazione del testicolo seguendo tre approcci Ricerca di modificatori genetici di SRY Intendiamo analizzare, mediante PCR e/o FISH, tutti i pazienti con forme di intersessualità di tipo XX per la presenza del gene SRY traslocato sull'X o su un autosoma. Viceversa, il gene SRY di tutti i pazienti con forme di intersessualità di tipo XY verrà amplificato e sequenziato alla ricerca di mutazioni "perdita di funzione". Questo tipo di mutazioni di SRY causa normalmente disgenesia gonadica ed inversione del sesso da maschio a femmina (sindrome di Swyer). Una forma di penetranza incompleta è stata tuttavia associata a sei diverse mutazioni missenso di SRY: in questi casi la stessa mutazione è stata individuata sia in pazienti con inversione del sesso che nel padre o in altri familiari (da parte paterna) con fenotipo normale maschile (vedi Jordan et al., 2000 per una review dei casi). Abbiamo già identificato, nella collezione di DNA di pazienti intersessuali presente nel nostro laboratorio, due pazienti XY con mutazioni "familiari" di SRY. Queste rare mutazioni costituiscono esempi di alleli deboli di SRY, la cui azione come fattore di determinazione del sesso è più sensibile dell'allele wild type a fattori ambientali e/o genetici. In almeno un caso riportato in letteratura (Vilain et al., 1992) la presenza di tre pazienti con inversione del sesso in due generazioni, suggerisce che la penetranza incompleta possa essere spiegata dalla segregazione di un unico modificatore genetico. Una situazione simile è nota nel topo, dove il trasferimento, mediante incrocio, di alcuni alleli di Sry derivati da Mus domesticus (ad esempio. Srypos) in particolari background genetici (ad esempio C57BL/6J (B6)), causa forme di intersessualità dovute ad uno sviluppo anomalo delle gonadi (Eicher et al., 1982; Palmer and Burgoyne 1991; Eicher et al., 1996). Un possibile modificatore genetico di SRY è il gene DAX1: é stato recentemente riportato che, nel topo, DAX1 è necessario per la mascolinizzazione della gonade in presenza di un allele debole di SRY (Meeks et al., 2003). Pensiamo che le mutazioni "familiari" di SRY rappresentino un'opportunità unica per l'identificazione dei modificatori genetici. Speriamo di identificare, tra i pazienti che verranno analizzati durante questo progetto di ricerca, nuove famiglie con mutazioni "familiari" di SRY. La regione codificante e (dove possibile) le regioni di regolazione di DAX1 e di altri potenziali modificatori genetici di SRY verranno quindi sequenziati negli individui chiave di queste famiglie. Identificazione di un gene coinvolto nella determinazione del testicolo. Lo studio si basa su una famiglia italiana (famiglia F) con elevata consanguineità, in cui sono presenti quattro maschi XX. All'interno di questa famiglia segrega, come carattere autosomico recessivo, una forma di ipercheratosi palmo-plantare (PPK), associata ad una forte predisposizione per il carcinoma squamoso della pelle (SCC). L'interpretazione genetica dei dati della famiglia suggerisce che PPK/SCC ed inversione del sesso siano la conseguenza di un unico difetto genetico che potrebbe coinvolgere geni contigui (o un singolo gene), ereditato in omozigosi negli individui affetti. Abbiamo come prima cosa escluso, la presenza del gene SRY traslocato sul cromosoma X o su un autosoma. Abbiamo quindi mappato il locus responsabile, mediante analisi di linkage, in una regione di circa 15 Mb omozigote "by descent" in tutti i membri della famigli affetti da PPK/SCC (e/o inversione del sesso). Abbiamo inoltre studiato l'unico altro caso di maschio XX con un fenotipo molto simile a quello dei pazienti della famiglia F, pubblicato in letteratura (Vernole et al., 2000). Il paziente, italiano e figlio di primi cugini, è risultato omozigote per la regione critica di circa 15 Mb individuata mediante linkage nella famiglia F. ma il suo aplotipo è completamente diverso da quello presente nei pazienti della famiglia F. Questo dato suggerisce che le due mutazioni siano indipendenti oppure che una sola mutazione sia avvenuta in un antenato comune (ma molto lontano) della famiglia F e del paziente sporadico. Molto recentemente (marzo 2004) abbiamo identificato il gene mutato in questi pazienti. Abbiamo infatti individuato una inserzione di un singolo nucleotide in un gene con una struttura molto interessante, nei membri affetti della famiglia F. L'inserzione, che si trova dopo la base 104 (codone 34) della sequenza codificante, causa uno slittamento della cornice di lettura ed in un codone di stop dopo dieci amminoacidi. La mutazione segrega come atteso nella famiglia F. Abbiamo inoltre individuato una delezione che include il primo esone codificante nel paziente sporadico. Pensiamo quindi di avere identificato il primo gene, a parte SRY, coinvolto nell'eziologia della sindrome di maschio XX nell'uomo.Come precedentemente discusso, è probabile che solo mutazioni in geni che stanno in cima alla cascata di eventi genetici della determinazione del sesso gonadico possano indurre la differenziazione di testicoli funzionali in un ambiente genetico femminile. Questo gene dovrebbe quindi partecipare ai primissimi eventi della determinazione del sesso ed è probabile cha la sua caratterizzazione permetta un notevole passo in avanti nel chiarimento di questo importante processo di sviluppo. L'individuazione di mutazioni "perdita di funzione" nei nostri pazienti maschi XX suggerisce che la repressione della trascrizione o della funzione di questo gene sia necessariaa per il normale sviluppo dei testicoli in individui XY. Intendiamo quindi analizzare i pazienti con forme di intersessualità di tipo XX per mutazioni inattivanti in questo nuovo gene. D'altra parte, poiché è logico pensare che l'espressione anomala di questo gene possa impedire la normale differenziazione del testicolo in individui XY, pensiamo di cercare di caratterizzarne le sequenze di regolazione e, in un prossimo futuro, cercare quindi mutazioni "guadagno di funzione" in pazienti con forme di intersessualità di tipo XY. Stiamo infine cercando un gene coinvolto in un inversione del sesso di tipo XY. E' stata recentemente descritta la localizzazione di un locus in 5q12 responsable per questo tipo di inversione del sesso in una grande famiglia francese (Jawaheer et al., 2003). Il gene responsabile non sembra essere stato ancora individuato. Abbiamo trovato che la mutazione responsabile per l'inversione del sesso in una delle nostre famiglie di femmine XY (famiglia C) mappa allo stesso locus. La regione è completamente sequenziata e stiamo quindi studiandone la mappa di trascrizione e sequenzando i geni candidati più probabili nei membri affetti della famiglia C.
