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Lo scopo del presente progetto di ricerca è di caratterizzare geneticamente una vasta popolazione italiana di malati CD e di capire i fattori genetici che sono associati alla forma stenosante della malattia. Attualmente, sono stati identificati tre geni di suscettibilità alle IBDs: CARD15/NOD2, MDR1 e MUC3. Tuttavia, questi tre geni non possono, da soli, spiegare l'intera patogenesi della malattia di Crohn. Le linee generali di questo progetto di ricerca sono le seguenti: 1. valutare la prevalenza delle varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 nella nostra popolazione CD al fine di paragonarla con quella delle popolazioni controllo e dei pazienti affetti da colite ulcerosa. 2. stabilire delle accurate correlazioni genotipo-fenotipo tra queste varianti allelche e e le caratteristiche fenotipiche dei pazienti CD, con particolare riguardo alla presenza di stenosi. 3. stabilire la presenza di associazione tra le varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 e caratteristiche istologiche specifiche come il grado di fibrosi della parete intestinale e l'iperproliferazione della muscolare della sottomucosa a livello della stenosi, in una serie di pazienti affetti da malattia di Crohn sottoposti ad intervento chirurgico. 4. stabilire l'associazione tra le varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3 e specifiche modificazioni della matrice extracellulare (deposizione di collagene tipo I e III, fibronectina e tenascina); 5. stabilire la presenza di linkage tra I loci di suscettibilità alle IBD e le famiglie CD al fine di identificare nuovi possibili geni candidati con particolare riguardo alla forma stenosante. I loci analizzati saranno i seguenti: IBD1 (Hugot et al., 1996), IBD2 (Satsangi et al., 1996), IBD3 (Yang et al., 1999), IBD4 (Ma et al., 1999), IBD5 (Cho et al., 1998) e IBD6 (Ma et al., 1999). Lo studio includerà oltre 400 pazienti consecutivi affetti da morbo di Crohn, seguiti presso l'ambulatorio di Gastroenterologia dell'Ospedale "L. Sacco" di Milano (l'ambulatorio ha attualmente in cura oltre 1000 pazienti affetti da morbo di Crohn). Dei pazienti saranno raccolti dati dettagliati relativi alla storia clinica che includono abitudini voluttuarie, familiarità per malattia infiammatorie intestinali, caratteristiche fenotipiche della malattia, terapia e precedenti interventi chirurgici eseguiti. Il sesso, l'età di sviluppo della malattia, l'origine etnica, la storia famigliare e la terapia medica saranno inoltre considerati. A questi pazienti saranno inoltre prelevati campioni di sangue per l'analisi delle varianti alleliche dei geni NOD2/CARD15, MDR1 e MUC3. Sarà quindi valutata in questa fase dello studio l'esistenza di correlazioni tra mutazione del gene NOD2/CARD15 e le caratteristiche fenotipiche della malattia, con riguardo alla presenza di stenosi ileali e ricercato il tipo di mutazione ad essa più strettamente associato. Le analisi genetiche saranno realizzate a partire da DNA genomico estratto da sangue periferico dei pazienti precedentemente descritti. La presenza delle tre principali mutazioni puntiformi del gene NOD2/CARD15 (Leu1007finsC, Arg702Trp, Gly908Arg) sarà valutata mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) a partire da DNA genomico e successivo sequenziamento di entrambi i filamenti utilizzando un sequenziatore automatico (Abi-3100, Applied Biosystems). Le reazioni di sequenza si baseranno sulla chimica dei dideossiterminatori e l'analisi di sequenza utilizzerà i software Sequenze Navigator e Factura (Applied Biosystems). Per quanto riguarda il gene MDR1, saranno studiati i seguenti polimorfismi di un singolo nucleotide (SNPs) localizzati in regioni esoniche: Asn21Asp, Gly412Gly, Ala893Ser, Ala893Thr e Ile1145Ile. L'analisi di tali polimorfismi sarà realizzata tramite amplificazione del DNA genomico per mezzo della PCR, seguita da digestione enzimatica dell'amplificato per valutare il polimorfismo dei frammenti di restrizione (RFLP). I risultati ottenuti saranno verificati mediante sequenziamento. Nel caso del polimorfismo Asn21Asp, questo protocollo sperimentale non è applicabile e di conseguenza tale variante sarà valutata tramite PCR a partire da DNA genomico e successivo sequenziamento di entrambi i filamenti. Infine per i geni MUC3A e MUC3B i polimorfismi di sequenza delle regioni esoniche situate in posizione 3' saranno genotipizzati tramite PCR seguita da ibridazione oligonucleotidica allele-specifica (ASO) Laddove questo metodo risulterà inapplicabile le analisi si effettueranno tramite sequenziamento diretto. Un'ulteriore fase dello studio includerà una serie congrua di pazienti CD, già genotipizzati, e sottoposti ad intervento chirurgico di resezione intestinale per la presenza di stenosi presso il Dipartimento di Chirurgia dell'Ospedale "L. Sacco" di Milano. Di questi pazienti, previa esclusione di quelli trattati con steroidi, anti-TNFalfa, ed immunosoppressivi, saranno analizzate le caratteristiche istomorfologiche e immunofenotipiche delle stenosi resecate per valutarne la natura infiammatoria o fibrotica ed il grado di fibrosi. In particolare, i tratti stenostici di per ciascun segmento intestinale resecato, saranno analizzati secondo i criteri istologici proposti da Fazio e coll. (Fazio et al. Ann Surg 1996). La valutazione di caratteri immunofenotipici, comprenderà l'analisi della muscolarizzazione della sottomucosa, i sottotipi di collagene, le proteine della matrice (laminina, fibronectina, tenascina) e i fattori di crescita determinati mediante anticorpi commerciali o home made. Tali caratteristiche saranno analizzate quindi in relazione al genotipo, per definire se quest'ultimo sia associato a specifiche alterazioni morfologiche delle stenosi. Lo studio prevede una fase collaborativa prospettica in cui: segmenti di stenosi ileali prelevati da pazienti con morbo di Crohn, afferenti al nostro Centro e già genotipizzati, portatori di specifici polimorfismi del gene NOD2/CARD15 (il/i tipo/i di mutazione prescelta sarà definito sulla base dei risultati della prima parte dello studio), segmenti di stenosi ileali di pazienti senza mutazione e segmenti di intestino tenue di pazienti operati per altre patologie saranno prelevati ed inviati, unitamente ad un campione di siero presso altra Unità di Ricerca (Pavia) per la caratterizzazione immunoistochimica della matrice extracellulare (dosaggio quantitativo dei livelli intratissutali di VEGF, b-FGF, TGF, IGF-I, collagene di tipo III, IV, VI, laminina, prolil-idrossilasi, acido ialuronico). In una fase successiva del progetto saranno reclutate famiglie CD per realizzare delle analisi di linkage basate sui loci di suscettibilità alle IBDs.. Le famiglie CD saranno selezionate in funzione della gravità del fenotipo, della struttura del pedigree e del numero di soggetti affetti. In particolare saranno reclutate famiglie CD con quadro fenotipico stenosante, ossia famiglie con soggetti sottoposti ad intervento chirurgico per stenosi. Di queste famiglie sarà inoltre effettuata un'analisi istomorfologica e immunofenotipica comparativa delle stenosi come sopra riportato. Queste ricerche avranno lo scopo di identificare nuovi geni suscettibili di malattia di Crohn, specificamente implicati nella sua forma stenosante, e di valutarne l'implicazione nella patogenesi della malattia. Per valutare la capacità delle famiglie raccolte di dare risultati positivi in analisi di linkage, sarà effettuata una simulazione utilizzando il programma SLINK (Ott J, 1989; Weeks et al., 1990). Questo tipo di valutazione sarà eseguita su tutte le famiglie raccolte utilizzando i fenotipi originali e simulando un marcatore con cinque alleli equifrequenti. Le analisi di linkage saranno realizzate in tutti i loci cromosomici candidati precedentemente descritti utilizzando coppie di primers (Applied Biosystems) al fine di amplificare dei marcatori microsatelliti specifici per ogni locus con una risoluzione approssimativa di 1cM. L'aplotipo di ogni individuo sarà identificato. Le analisi di segregazione dei marcatori microsatelliti saranno realizzate nelle famiglie CD usando un sequenziatore automatico (ABI3100) e i programmi informatici Genotyper e Genescan (Applied Biosystems). Le analisi di linkage saranno realizzate per mezzo dei pacchetti informatici LINKAGE e GENEHUNTER e i LOD scores di analisi two point e multipoint saranno calcolati. Le regioni cromosomiche che mostreranno la presenza di linkage (valori LOD scores positivi, anche se statisticamente non significativi) saranno saturate con marcatori microsatelliti supplementari scelti tra quelli disponibili nella banca dati NCBI In particolare, la ricerca di nuovi geni candidati nella patogenesi delle IBDs sarà svolta tramite un'analisi informatica delle regioni cromosomiche implicate, negli uomini e nel topo per mezzo delle seguenti banche dati http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human e http://www.ensembl.org/Mus_musculus. I geni identificati saranno mappati tramite allineamento di sequenza (BLAST search) dei rispettivi cDNAs alle sequenze disponibili nella banca dati informatica NCBI Human Genome Data Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human). I geni identificati saranno infine sequenziati come precedentemente descritto.
