RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI

Università di riferimento

Università degli Studi di NAPOLI "Federico II" - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - NAPOLI(NA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gerardo NARDONE

Descrizione

L’obiettivo della nostra unità di ricerca è quello di identificare marcatori di predittività biologica nelle lesioni preneoplastiche e neoplastiche dello stomaco in grado di individuare pazienti con gastrite cronica a rischio carcinogenetico e come indicatori di prognosi e risposta alla chemioterapia nei pazienti con cancro gastrico. La nostra unità dispone di una banca biologica, costituita da: 1. Campioni di tessuto di tumore primitivo e mucosa istologicamente sana relativi a 100 pazienti sottoposti a resezione chirurgica potenzialmente curativa per CG e con almeno 5 anni di follow-up raccolti in collaborazione con l'Istituto dei Tumori Pascale. Tutti i casi di CG sono selezionati in base alla diagnosi di adenocarcinoma gastrico confermata istologicamente; intervento chirurgico radicale (margini di resezione istologicamente negativi per infiltrazione); assenza di precedente (entro 5 anni) o concomitante altra neoplasia maligna; chemioterapia o radioterapia pre-operatoria. 2. Campioni di tessuto di mucosa gastrica (sia congelata che paraffinata), sangue e siero raccolti da 195 pazienti afferenti alla nostra unità di endoscopia digestiva per dispepsia cronica. Sono stati esclusi pazienti in trattamento con antisecretori, antibiotici ed anticoagulanti nelle tre settimane precedenti l’esame endoscopico e i pazienti con patologia tumorale o con severe malattie sistemiche. Prelievi bioptici endoscopici di corpo, antro (area prepilorica) e angulus gastrico, raccolti secondo il protocollo di campionamento minimo standard del Sydney system, sono stati in parte fissati in formalina ed inclusi in paraffina per essere utilizzati per l’esame istologico e in parte congelati in azoto e conservati a -80 °C per lo studio molecolare (RT-PCR e Western Blot). Di circa 70 casi sono inoltre disponibili campioni di tessuto, sangue e siero raccolti dopo almeno 6 mesi dal trattamento eradicante per l’infezione da H. pylori suddivisi in base alla risposta alla terapia (responder o resistenti). Dati epidemiologici (caratteristiche demografiche, storia familiare, abitudini alimentari, stile di vita), clinici (storia clinica, esame obiettivo, esami di laboratorio e strumentali) ed anatomo-patologici (classificazione secondo Lauren, grado di differenziazione e stadio TNM per i tumori e infezione da H. pylori e presenza di lesioni preneoplastiche per le gastriti) relativi ai casi collezionati sono registrati in un database computerizzato. DESCRIZIONE PARTICOLAREGGIATA DEL PROGETTO DI RICERCA Il programma si realizzerà attraverso le seguenti fasi: 1. Implemento della banca biologica 2. Analisi molecolare dei campioni di CG e gastrite (COX-2, mPGE2S, PPAR-gamma, midkina) 3. Valutazione della produzione mucosale di PGE2 4. Studio dell'apoptosi (bcl-2, bcl-xl, survivina, p53); 5. Studio dei polimorfismi germinali dei recettori nucleari PPAR; 6. Analisi statistica; 1. IMPLEMENTO DELLA BANCA BIOLOGICA La banca biologica già costituita verrà implementata mediante raccolta di campioni di tessuto fresco, sangue e siero provenienti sia da pazienti affetti da CG sottoposti a resezione chirurgica che da pazienti con gastrite afferenti alla nostra unità di endoscopia digestiva. Si prevede di reclutare almeno 40 casi di CG ed altri 100 casi di gastrite che saranno prospetticamente seguiti nel tempo. In accordo al protocollo seguito per i casi già disponibili, per ciascun soggetto arruolato aliquote ematiche (sangue intero e siero) e parte dei campioni tissutali o dei loro estratti (RNA, cDNA, proteine) verranno conservate a –20 °C e –80 °C, rispettivamente per essere utilizzati per le indagini molecolari e per essere inviati mediante trasporto protetto (in ghiaccio secco ed a –20°C) dal nostro centro presso le altre unità operative al fine di completare lo studio, in base alle specifiche competenze. Ciascun paziente sarà identificato tramite un codice alfanumerico e sia i dati anamnestici che i risultati delle varie indagini saranno accessibili solo tramite codice al fine di rispettare la confidenzialità. Un consenso informato scritto sarà richiesto ad ogni soggetto che aderirà allo studio prima dell’arruolamento. Lo studio sarà sottoposto all’approvazione del comitato etico locale in accordo alle direttive internazionali. 2. ANALISI MOLECOLARE L’espressione di COX-2, mPGE2S, P-gp, PPAR-gamma e isoforme correlate, midkina (wild type e troncata) sarà studiata mediante immunoistochimica, RT-PCR e Western Blot sui campioni di cancro gastrico e gastrite. La valutazione immunoistochimica verrà effettuata su sezioni paraffinate di tessuto gastrico trattate con anticorpi primari specifici. Il grado di positività sarà valutato semiquantitativamente su un totale di almeno 400 cellule (0-5% negativo; 5-25% bassa positività; 25-50% moderata positività, > 50% alta positività). La valutazione dell'espressione di mRNA verrà effettuata via RT-PCR su cDNA ottenuto da RNA totale estratto con metodo del Trizol da omogenati di campioni bioptici. Successivamente si procederà a valutazione densitometrica semiquantitativa delle varie bande ottenute e normalizzate per i valori di un marcatore interno (actina). L'analisi dell' espressione proteica mediante Western-Blot verrà valutata su estratti proteici di omogenati di mucosa gastrica separati per elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e poi trasferiti su membrana di nitrocellulosa. Le varie proteine saranno identificate usando specifici anticorpi primari opportunamente diluiti e successivamente incubati con i complementari anticorpi secondari. La visualizzazione delle bande sarà effettuata per chemioluminescenza. 3. VALUTAZIONE PRODUZIONE MUCOSALE DI PGE2 La quantità di prostaglandina (PG)E2, principale mediatore attivo dell’attività della COX-2, sarà valutata su campioni bioptici di mucosa gastrica. In particolare le biopsie di mucosa gastrica saranno coltivate e il sovranatante della coltura d'organo verrà utilizzato per misurare i livelli di PGE2 mediante ELISA (Cayman Chemical Ann Arbor, MI, USA). 4. STUDIO APOPTOSI L’apoptosi o morte cellulare programmata verrà valutata mediante lo studio della espressione di proteine regolatrici ad attività anti-apoptotica, Bcl-2, Bcl-xl, survivina e p53 (forma wild type e mutata) per immunoistochimica, RT-PCR e Western Blot. 5. STUDIO DEI POLIMORFISMI GERMINALI DEI RECETTORI NUCLEARI PPAR Materiale biologico (sangue, siero e tessuti o estratti da tessuti) sarà inviato mediante trasporto protetto (in ghiaccio secco ed a –20°C) dal nostro centro presso l'Unità di Bologna dove verrà effettuato lo studio dei polimorfismi germinali dei recettori nucleari PPAR. I risultati ottenuti saranno successivamente correlati con i parametri clinico-patologici e molecolari della popolazione studiata. 6. ANALISI STATISTICA Uno specifico database sarà completato dopo accurata procedura di codificazione ed archiviazione dei dati. La correlazione statistica tra gli aspetti clinici, morfologici e molecolari sarà effettuata con il programma SPSS applicato a Windows. TEMPI DI REALIZZAZIONE Disponendo la nostra unità di ricerca di una banca biologica già costituita, si prevede che entro la fine del primo anno sarà completato lo studio immunoistochimico e la valutazione molecolare (RT-PCR e Western blot) dei casi di gastrite e cancro gastrico già disponibili. Successivamente, lo studio sarà esteso ai casi di nuovo arruolamento e si procederà alla correlazione dei dati molecolari con i parametri clinico-patologici.