RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI

Università di riferimento

Università degli Studi di PAVIA - MEDICINA SPERIMENTALE - PAVIA(PV)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Vittorio RICCI

Descrizione

Scopo principale di questa ricerca sarà lo studio in vitro delle vie di trasduzione del segnale attraverso cui H. pylori stimola l'aumentata espressione di COX-2 nonché di quelle attraverso cui COX-2 estrinseca il suo importante ruolo nella patologia da H. pylori. In questo contesto, dal 1990 questa Unità di Ricerca si dedica allo studio delle interazioni fra H. pylori e cellule epiteliali gastriche umane in vitro. Nell'ambito di un estesa rete di collaborazioni nazionali ed internazionali, la nostra Unità di Ricerca ha contribuito a chiarire il ruolo ed il meccanismo d'azione di vari fattori di virulenza di H. pylori nel danno gastrico causato da tale batterio. Questa attività è documentata dai numerosi lavori pubblicati su riviste internazionali a severo controllo redazionale (Ricci et al., 1996, 1997, 2000, 2002 a&b; Romano et al., 1998 a&b; Sommi et al., 1998; Galmiche et al., 2000; Boquet et al., 2003; Caputo et al., 2003; Busiello et al, 2004). In questo studio, il nostro principale modello sperimentale sarà rappresentato da cellule epiteliali gastriche umane in coltura. In particolare, utilizzeremo le linee cellulari MKN 28 e AGS. Queste linee cellulari sono ben caratterizzate e sono già state utilizzate in precedenza sia dal nostro che da altri gruppi nello studio del meccanismo d'azione dei fattori di virulenza di H. pylori (Ricci et al., 1997; Romano et al., 1998 a&b; Keates et al., 1999; Naumann et al., 1999; Juttner et al., 2003; Busiello et al., 2004). Oltre ad essere di origine gastrica, queste linee cellulari mostrano un fenotipo gastrico, una differenziazione parzialmente polarizzata con una superficie apicale molto simile a quella dell'epitelio gastrico umano di superficie e presentano un binding specifico per l' H. pylori con la formazione dei caratteristici piedestalli di adesione. Inoltre, in stretta collaborazione con l'Unità di Ricerca di Catanzaro, utilizzeremo colture d'organo di biopsie gastriche umane ottenute da pazienti H. pylori-negativi. Questo modello sperimentale consente infatti studi in vitro su mucosa gastrica architetturalmente integra ed in cui tutti i differenti tipi cellulari rimangono funzionalmente attivi. Tali modelli sperimentali saranno cimentati sia con sospensioni batteriche (allestendo quindi cocolture di H. pylori e cellule epiteliali) che con filtrati di brodocoltura di un ampia gamma di ceppi di H. pylori, a genotipo e fenotipo ben caratterizzato, sia wild-type che mutanti di laboratorio defettivi di specifici fattori di virulenza. In particolare, utilizzeremo i seguenti ceppi batterici: 1) 60190 (ATCC 49503), ureasi+/VacA+/PAI cag+, uno dei più diffusi ceppi standard e da cui è stata originariamente purificata la VacA, 2) 60190:v1, mutante isogenico del ceppo 60190 in cui il gene vacA è stato distrutto per mutagenesi inserzionale, 3) 60190:M22, mutante isogenico del ceppo 60190 in cui il gene cagA è stato distrutto per mutagenesi inserzionale, 4) 60190:C-, mutante isogenico del ceppo 60190 in cui il gene cagE è stato distrutto per mutagenesi inserzionale, 5) 60190-4, mutante spontaneo ureasi- del ceppo 60190, 6) CCUG 17874, ureasi+/VacA+/PAI cag+, altro ceppo standard di riferimento, 7) G21, ureasi+/VacA-/PAI cag-, 8) M5, ureasi+/VacA+/PAI cag+, ed il suo mutante isogenico M5ggt::aph in cui, per mutagenesi inserzionale, è stato distrutto il gene ggt codificante per la γ-glutamiltranspeptidasi (GGT) dimostrata (Busiello et al. 2004) essere un importante fattore di virulenza di H. pylori. Infatti, la GGT causa sia overespressione di cicloossigenasi-2 che produzione di radicali liberi dell'ossigeno (ROS) con conseguente attivazione di NFkB, importante regolatore della produzione di citochine e chemochine (Naumann, 2000). Inoltre, utilizzeremo anche specifici fattori di virulenza purificati, in particolare VacA e GGT, che saranno prodotti nel nostro laboratorio. Il disegno sperimentale sarà articolato nelle seguenti 3 parti. Mentre la prima parte sarà svolta prevalentemente durante il primo anno di ricerca, alle altre due verrà dedicato il secondo anno. 1) Effetti di H. pylori sulle vie di trasduzione del segnale che portano ad aumentata espressione di COX-2 Questa parte dello studio verrà condotta in stretta collaborazione con l'Unità di Ricerca di Napoli e sarà a sua volta articolata in 3 gruppi di espermenti: a) Nel primo gruppo di esperimenti, cellule MKN 28 and AGS saranno incubate per tempi diversi (da 2 a 72 ore) sia con sospensioni batteriche (concentrazione finale: 5x10esp7 CFU/ml) che con filtrati di brodocoltura dei vari ceppi di H. pylori e verrà valutata sia l'aumentata espressione di COX-2 che l'attivazione delle differenti vie di trasduzione del segnale. In particolare, studieremo le vie di trasduzione dipendenti dalle MAP chinasi e da NFkB. Le vie delle Mitogen Activated Protein (MAP) chinasi trasducono segnali originati da un ampia gamma di stimoli extracellulari. Le 3 principali vie di trasduzione MAP chinasi-dipendenti coinvolgono (i) la extracellular regulated kinase (ERK 1&2), (ii) la MAP chinasi p38 e (iii) la c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) (Keates et al., 1999). NFkB comprende una famiglia di fattori di trascrizione inducibili che svolgono un importante funzione regolatoria nella risposta immunitaria ed infiammatoria. La stimolazione della via NFkB è mediata da diverse cascate di trasduzione del segnale. Questi segnali attivano le chinasi IkB (IKKα e IKKβ) che fosforilano delle proteine inibitorie dette IkB causando la loro ubiquitinazione e degradazione dal proteasoma. La degradazione di IkB causa la traslocazione di NFkB dal citoplasma al nucleo dove attiva l'espressione di specifici geni causando, per esempio, l'aumentata espressione di ossido nitrico sintetasi e di COX-2. A differenti intervalli di tempo, l'espressione di COX-2 sarà valutata sia a livello di mRNA che di proteina mediante rispettivamente Northern e Western blot, mentre la produzione di prostaglandine indotta da COX-2 sarà misurata con la tecnica ELISA (Romano et al., 1998b). L'attivazione delle differenti MAP chinasi sarà valutata mediante Western blot utilizzando specifici anticorpi contro le forme fosforilate e non fosforilate di ciascuna chinasi (Keates et al., 1999; Caputo et al., 2003). L'attivazione di NFkB sarà studiata sia mediante electrophoretic mobility shift assay (EMSA) (Juttner et al., 2003) che misurando la degradazione di IkB in Western blot e densitometria (Keates et al., 1999). Questi esperimenti dovrebbero gettare nuova luce sia sulle vie di trasduzione del segnale attivate da H. pylori e che si associano all'aumentata espressione di COX-2 che sugli specifici fattori di virulenza coinvolti. b) In un secondo gruppo di esperimenti, analizzeremo il ruolo di ciascuna via di trasduzione del segnale nell'aumentata espressione complessiva di COX-2 indotta da H. pylori. A tal fine, cellule MKN 28 ed AGS esposte all'H. pylori saranno trattate con un'ampia gamma di farmaci ad azione specifica sulle differenti vie di trasduzione. In particolare, utilizzeremo: 1) l'inibitore di NFkB pyrrolidine dithiocarbamate; 2) l'inibitore della fosforilazione di IkB Bay 117082; 3) l'inibitore di MEK PD 098059; 4) l'inibitore della chinasi JNK SP-600125; 5) l'inibitore della chinasi p38 SB203580; 6) LY294002, inibitore della fosfatidilinositol-3 chinasi il cui ruolo è importante per l'attivazione di NFkB e nell'aumentata espressione di COX-2 indotta da GGT (Busiello et al., 2004); 7) SC-236, inibitore selettivo di COX-2. Al termine dell'incubazione cellulare, analizzeremo come sopra descritto sia l'espressione di COX-2 che l'attivazione delle differenti vie di trasduzione. Questi esperimenti dovrebbero consentirci di chiarire sia la cascata di attivazione delle differenti vie che portano all'aumentata espressione di COX-2 che i loro rispettivi ruoli nell'azione complessiva di H. pylori. Per esempio, la relazione tra le vie delle MAP chinasi e NFkB è ancora controversa (Kim et al., 2001; Juttner et al., 2003). Inoltre, è stato recentemente suggerito che l'attivazione di NFkB non è un prerequisito per l'espressione di COX-2, ma al contrario un effetto conseguente all'espressione di COX-2 e che stimola l'espressione di chemochine (ENA-78 ed interleuchina-8) associate alla crescita tumorale ed all'angiogenesi (Pold et al., 2004). c) In una terza serie di esperimenti, studieremo se e come l'aumentata espressione COX-2 indotta da H. pylori dipenda dall'attivazione di una via Rho-dipendente. L'importanza delle GTPasi Rho (Rho, Rac e Cdc42) nel danno da H. pylori è sottolineata dalla dimostrazione di Palovuori et al. (2000) che H. pylori causa la formazione di fibre da stress ed altre alterazioni del citoscheletro di actina essenzialmente attraverso l'attivazione della GTPasi Rac. Inoltre, Slice et al. (1999) hanno dimostrato che l'attivazione di una via Rho-dipendente causa aumentata espressione di COX-2. A tal fine, utilizzeremo sia monostrati di cellule MKN 28 e AGS sia normali che in cui avremo indotto specifiche alterazioni della plasticità citoscheletrica e della trasduzione del segnale ad essa correlata per mezzo di tossine batteriche purificate che interferiscono con le GTPasi Rho. In dettaglio, utilizzeremo: 1) il cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1) di Escherichia coli, che attiva le GTPasi Rho, 2) l'esoenzima C3 di Clostridium botulinum, che a concentrazione relativamente bassa inattiva selettivamente Rho, mentre a concentrazione 100 volte più alta inattiva anche Rac e Cdc42, 3) la tossina B di Clostridium difficile, che inattiva Rho, Rac e Cdc42, 4) la tossina letale di Clostridium sordellii, che inattiva selettivamente Rac e Cdc42. 2) Meccanismi con cui VacA and GGT innescano la trasduzione del segnale che porta all'aumentata espressione di COX-2 Questa parte dello studio sarà divisa in 2 gruppi di esperimenti: a) In un primo gruppo di esperimenti, studieremo la relazione fra VacA e le vie di trasduzione del segnale che portano alla ed originano dalla aumentata espressione di COX-2. E' ormai noto che VacA è un importante fattore di virulenza di H. pylori dai molteplici ruoli (Ricci et al., 2002b; Boquet et al., 2003; Naumann and Crabtree, 2004). Entrata nelle cellule epiteliali, VacA induce il rigonfiamento degli endosomi tardivi causando vacuolizzazione citoplasmatica e raggiunge i mitocondri dove causa rilascio di citocromo c ed apoptosi (Boquet et al., 2003). Inoltre, attraverso un meccanismo ancora non chiaro, VacA attiva una via di trasduzione del segnale dipendente dal recettore per l'EGF che attraverso l'attivazione della chinasi p38 kinase porta all'aumentata espressione di COX-2 che ha effetto antiapoptotico e causa aumentata espressione di VEGF nelle cellule epiteliali gastriche (Caputo et al., 2003). NSAIDs come l'aspirina e l'indometacina e come l'NS-398, un inibitore selettivo di COX-2, prevengono anche la vacuolizzazione cellulare indotta da VacA (Ricci et al., 2002a). Nei linfociti T, l'attivazione di p38 e l'aumentata espressione di COX-2 causa una deficitaria attivazione cellulare che, prevenendo un'efficace risposta immunitaria, favorirebbe la cronicizzazione dell'infezione gastrica da H. pylori (Boncristiano et al., 2003). L'attivazione di p38 stimola anche l'endocitosi (Cavalli et al., 2001) e potrebbe quindi favorire l'internalizzazione cellulare di VacA. È stato recentemente ipotizzato che VacA causi attivazione di p38 interagendo con il recettore di superficie Ptprz (Fujikawa et al., 2003, Nakayama et al., 2004) il cui ruolo nella vacuolizzazione cellulare è peraltro controverso dal momento che cellule altamente sensibili all'attività vacuolizzante di VacA (HeLa, per esempio) non esprimono tale recettore (Ricci et al., dati non pubblicati). In questo contesto, verificheremo l'espressione di Ptprz da parte delle cellule MKN 28 e AGS e, utilizzando sia anticorpi bloccanti il recettore Ptprz che cellule trattate con citocalasina D (in modo da bloccare l'internalizzazione cellulare di VacA), studieremo se l'attivazione di p38 indotta da VacA richiede legame a tale recettore e se è indipendente dall'entrata della tossina nella cellula. A tal fine, oltre ai ceppi di H. pylori VacA+ e VacA-, utilizzeremo anche tossina purificata per evitare ogni possibile interferenza con altri fattori di virulenza. Considerando che VacA avrebbe un'azione sia apoptotica diretta che anti-apoptotica indiretta (attraverso l'aumentata espressione di COX-2), studieremo la risultante di queste contrastanti azioni su biopsie gastriche umane in coltura d'organo sia esposte a VacA purificata che infettate con ceppi VacA+ e VacA-. Analizzeremo quindi: 1) l'entrata cellulare di VacA e la sua distribuzione intracellulare nei differenti tipi cellulari mediante immunofluorescenza ed immunocitochimica ultrastrutturale; 2) l'attivazione di p38 e l'aumentata espressione di COX-2 come sopra descritto; 3) l'indice apoptotico mediante tecnica TUNEL; 4) l'espressione di VEGF mediante Western blot. Questi esperimenti verranno condotti in stretta collaborazione con l'Unità di Ricerca di Catanzaro. b) Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che la GGT è il fattore di virulenza di H. pylori principalmente responsabile dell'aumentata espressione di COX-2 e peptidi EGF-correlati nelle cellule epiteliali gastriche umane (Busiello et al., 2004). Tuttavia, il meccanismo d'azione della GGT non è stato studiato a fondo. In particolare, non è chiaro se GGT inneschi un segnale in seguito alla produzione, all'esterno della cellula, di glutammato e cisteinil glicina dal glutatione secreto o, al contrario, se GGT agisca all'interno della cellula. In questo contesto, studieremo se l'incubazione di cellule MKN 28 e AGS con glutammato e cisteinil glicina causa aumentata espressione di COX-2. Mediante immunofluorescenza in microscopia confocale, studieremo anche se e come GGT entra nelle cellule epiteliali gastriche. E' stato recentemente proposto che la scissione del glutatione ad opera della GGT causa produzione di ROS che stimolerebbe, attraverso l'attivazione di NFkB, l'espressione di COX-2 (Kim et al., 2002). Per esplorare questa possibile via di trasduzione, incuberemo cellule MKN 28 e AGS con GGT purificata in presenza ed in assenza sia di mannitolo, un noto scavenger dei ROS, che dell'enzima anti-ossidante superossido dismutasi. L'attivazione di NFkB sarà studiata come descritto sopra. 3) Aumentata espressione di chemochine CXC ad azione angiogenetica come effetto dell'aumentata espressione di COX-2 Abbiamo precedentemente dimostrato che dall'aumentata espressione di COX-2 origina un'importante via di trasduzione del segnale che porta ad aumentata espressione del potente fattore angiogenetico VEGF (Caputo et al., 2003). E' inoltre ben noto che la progressione tumorale è strettamente connessa all'angiogenesi risultante da un aumento dell'espressione di fattori angiogenetici non contrastato da un parallelo aumento di fattori angiostatici (Pold et al., 2004). In questa parte della ricerca, studieremo la possibilità che l'aumentata espressione di COX-2 indotta da H. pylori possa causare nelle cellule epiteliali gastriche un'aumentata espressione delle chemochine CXC ad azione angiogenetica ENA-78 e interleuchina-8 atttraverso l'attivazione di NFkB, come dimostrato nel cancro del polmone non a piccole cellule (Pold et al., 2004). A tal fine, cellule MKN 28 e AGS saranno incubate sia con sospensioni batteriche che con filtrati di brodocoltura di H. pylori che con GGT purificata, in presenza ed in assenza sia di inibitori selettivi di COX-2 che dell'inibitore di NFkB pyrrolidine dithiocarbamate. Al termine dell'incubazione, misureremo la sintesi cellulare e la secrezione extracellulare delle chemochine CXC angiogenetiche mediante ELISA e citometria a flusso. Questi esperimenti dovrebbero consentirci di delineare un quadro più completo del ruolo dell'aumentata espressione di COX-2 nell'ambito dell'azione patogenetica dell'H. pylori.