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INIZIO_TESTO_DA_INDICIZZARE

UNITA' DI RICERCA

italiano - english
Bibliografia
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Programma di ricerca

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI
Università di riferimento
Università degli Studi di BOLOGNA - MEDICINA INTERNA E GASTROENTEROLOGIA - BOLOGNA(BO)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Berardino VAIRA
Descrizione
Si intende classificare epidemiologicamente e/o clinicamente gastriti croniche e cancri gastrici selezionati per identificare geni, vie metaboliche e molecolari e genotipo coinvolti nell'insorgenza del cancro gastrico. A questo scopo saranno utilizzate tecniche farmacogenomiche per chiarire il ruolo patologico o fisiologico di questa classe di recettori nucleari nei pazienti in esame valutando l'eventuale diversità di assetto genetico degli stadi più o meno avanzati della cancerogenesi Il programma di ricerca verterà sui seguenti punti: 1. Popolazione in studio Saranno raccolti per ogni paziente che entrerà nello studio: informazioni individuali e sulla dieta, stile di vita, storia familiare, e altri fattori di rischio. Questo avverrà compilando un questionario. Un consenso scritto verra' richiesto ad ogni paziente prima dell'eventuale partecipazione allo studio. The Human Institutional Review Board of Bologna University, St. Orsola-Malpighi Hospital, Bologna, Italy, ha approvato ilprotocollo, in accordo con le direttive internazionali. Circa 70 pazienti affetti da gastrite e circa 30 con carcinoma gastrico si prevede possano essere arruolati e partecipare allo studio nei 24 mesi previsti per lo studio. Lo scopo del lavoro sara' quello di studiare contemporaneamente nelle diverse Unita'multi-centriche coinvolte, gli stessi soggetti, considerando per ciascuno di essi un diverso aspetto genotipico o fenotipico, utilizzando differenti metodiche. Materiale biologico (sangue, siero e tessuti o estratti) sarà inviato mediante trasporto protetto (in ghiaccio secco ed a -20°C) presso le altre unità operative al fine di completare lo studio molecolare in base alle specifiche competenze. I dati ottenuti saranno confrontati con quelli di volontari (200 controlli) provenienti dalle medesime aree geografiche non affetti da patologie gastroenteriche. 2.Campionamento bioptico Nella nostra unita' saranno eseguite esofagogastroduodenoscopie in anestesia locale con xilocaina somministrata dallo stesso esaminatore (DV) usando un endoscopio Olympus GIF 100 video. Le attuali direttive internazionali saranno utilizzate come criterio di classificazione delle lesioni. Saranno effettuati diversi prelievi bioptici in antro (sei in area prepilorica),in corpo (quattro lungo la piccola e quattro lungo la grande curvatura)e dell'angulus (due prelievi). Queste biopsie verranno inviate alle altre Unità coinvolte nello studio, mentre per l'istologia (Colorazione di Ematossilina-Eosina e colorazione di Giemsa) un campione sarà prelevato dall'antro per effettuare l'esame colturale (eseguito su agar Columbia selettivo arricchito con sangue sterile di cavallo al 5 % in condizioni microaerofile a 37°C); un ulteriore campione dall'antro sarà prelevato per eseguire il test rapido all'ureasi. 3. Infezione da HP In accordo alle linee guida internazionali per gli studi clinici riguardanti le infezioni da HP, saranno considerati positivi all'infezione da HP i pazienti con due o piu' esami positivi e/o se la coltura da sola risulterà positiva. Quindi, saranno considerati positivi all'infezione da HP solo coloro i quali avranno: l'istologia (giemsa in antro, corpo, o entrambi) e test all'ureasi positivi, e/o se la coltura da sola positiva. Saranno classificati come negativi all'infezione da HP tutte le altre combinazioni di risultati. 4. Campioni di sangue e estrazione di DNA Verranno prelevati per ciascuno delle persone inserite nello studio (pazienti + controlli) 8 mL di sangue in una provetta contenente 875 µL di acido D-citrico 0.109 M, e conservati a -80°C fino a quando sara' effettuata l'estrazione di DNA. Per l'estrazione verra' utilizzato il protocollo di Daly modificato. Il DNA così ottenuto, sara' esposto a temperatura ambiente per 5-7 minuti e risospeso in 500 µL di Tris- EDTA (10 mM/L Tris HCl, pH 7.4; 1 mM/L EDTA, pH 8.0). 5. Rilevazione dei polimorfismi e sequenziamento fluorimetrico Verranno considerati contemporaneamente tutti gli alleli considerati dei PPAR su tutti i pazienti reclutati, in modo da possedere un'impronta genotipica tale da cercare di chiarire l'eventuale ruolo di ogni singolo allele e variante nel processo della cancerogenesi. Indagini genetiche sui polimorfismi correlati ai geni del PPAR (anche quelli provenienti dalle altre Unità operative) saranno centralizzati presso i nostri laboratori. I dati ottenuti saranno quindi confrontati con quelli di controlli della medesima area di provenienza. Infine, si valuteranno i dati in base alla loro provenienza epidemiologica. Durante un periodo di due anni, si procedera' quindi all'estrazione del DNA proveniente da sangue intero ed alla sua amplificazione mediante PCR utilizzando primer specifici per l'individuazione dei polimorfismi aminoacidici genomici. Utilizzando la tecnica RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction), verranno ricercati un allele per il PPAR alfa (*3), due per il PPAR gamma (*2,*3) e uno per il PPAR delta. Si procedera' alla conferma dei risultati ottenuti mediante sequenziamento, utilizzando un sequenziatore fluorimetrico Applied Biosystems 373 (Foster City, CA; USA). 6. Analisi Statistiche Si effettueranno analisi statistiche per valutare l'eventuale correlazione tra polimorfismi e cancro gastrico, e quindi per confermare l'ipotesi assunta. La correlazione prenderà in esame il genotipo riscontrato, le caratteristiche epidemiologiche e clinico-patologiche, tra cui la dieta, l'esposizione a carcinogeni alimentari, lo status HP, predisposizione familiare al cancro gastrico, e prognosi. I dati ottenuti saranno quindi equiparati sia a quelli di volontari sia con quelli ottenuti attraverso la collaborazione con le altre unità di ricerca. 7. Banca Biologica Per ciascun soggetto arruolato aliquote ematiche (sangue intero e siero) e parte dei campioni o dei loro estratti (RNA, cDNA, proteine) verranno conservate a -20°C e -80°C, rispettivamente, al fine di costituire una banca di campioni biologici su cui poter effettuare nel tempo ulteriori caratterizzazioni molecolari.