RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI

Università di riferimento

Università degli Studi "Magna Graecia" di CATANZARO - MEDICINA SPERIMENTALE E CLINICA - CATANZARO(CZ)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Francesco LUZZA

Descrizione

Scopi specifici del progetto sono i seguenti: 1. Verificare se l'espressione di COX-2 è aumentata nella mucosa gastrica con infezione da H. pylori; 2. Misurare i livelli di PGE2 nei sovranatanti di colture di biopsie gastriche ottenute da pazienti con e senza infezione da H. pylori; 3. Valutare se la coltura di biopsie gastriche con specifici inibitori di COX-2 o con PGE2 influenza l'attivazione dei fattori di trascrizione STAT 1, STAT 4, STAT 6, T-bet e GATA 3 e il rilascio di IL-12, IFN-gamma, IL-4 e l'espressione di IL-12Rbeta2. Tutti i dati verranno correlati con il grado di gastrite e la presenza di cancro gastrico. Reclutamento dei pazienti e campionamento Verranno reclutati cinquanta pazienti con indicazione ad eseguire a esofagogastroduodenoscopia. I pazienti precedentemente sottoposti a terapia eradicante l'H. pylori o terapia antibiotica o con farmaci antiinfiammatori non steroidei nei due mesi precedenti alla visita verranno esclusi. Nel corso dell'endoscopia verranno prelevate tre biopsie antrali: una per effettuare il test rapido all'ureasi (Yamanouchi Pharma, Milano, Italia), due per l'estrazione dell'RNA e delle proteine al fine di valutare l'espressione di COX-2 mediante RT-PCR e Western Blotting. Altre quattro biopsie (due antrali e due nel corpo) verranno prelevate per l'esame istologico. I campioni bioptici verranno fissati in paraffina, processati e colorati con Giemsa per valutare la presenza dell'H. pylori. La severità e l'attività della gastrite, la densità della colonizzazione batterica, l'atrofia e la metaplasia intestinale verranno valutati mediante lo score della classificazione di Sydney: 0, assenza; 1, lieve; 2, moderata; 3, severa. Verrà anche effettuato il 13C-urea breath test (Cortex, Italia) per valutare l'H. pylori status. I pazienti verranno classificati come affetti da infezione da H. pylori quando due dei tre test risulteranno positivi. Sarà necessario che tutti e tre i test risultino negativi per classificare un paziente non infetto. Verranno inclusi anche pazienti con cancro gastrico (n=10). Biopsie verranno prelevate dalle aree circostanti il tumore gastrico e processate analogamente a quanto già descritto. Verrà ottenuto il consenso informato scritto da parte dei pazienti. Il progetto verrà sottoposto all'approvazione da parte del Comitato Etico locale. Colture di biopsie gastriche Ulteriori biopsie antrali (n=3) verranno poste su una griglia sterile in una camera per coltura d'organo a 37° a 5% CO2/95% O2 con RPMI 1640, al 5% FBS, 10mM L-Glutammina e 4ml/L Skirrow per 24 h (Sigma, St. Louis, MO, USA; Oxoid, Hampshire, England). Le biopsie di ogni paziente verranno coltivate con e senza inibitori di COX-2 NS-398 (10 microg/ml e 100 microg/ml, Sigma) o di PGE2 (0.01 microM e 1 microM, SIGMA) nel mezzo. Alla fine del trattamento, il sovranatante della coltura d'organo verrà conservato e utilizzato per misurare i livelli di IL-12, IFN-gamma e IL-4 mediante ELISA. Nei sovranatanti di colture senza PGE2 verrà anche misurata la PGE2 mediante ELISA (Cayman Chemical Ann Arbor, MI, USA). Le proteine estratte dal tessuto verranno utilizzate per valutare l'espressione di STAT 1, STAT 4, STAT 6, T-bet e GATA 3 mediante Western Blotting. L'RNA estratto sarà utilizzato per misurare l'espressione di IL-12Rbeta2 mediante RT-PCR. Estrazione di proteine e Western Blotting Le proteine totali verranno estratte dalle cellule usando il lysis buffer [50 mM HEPES pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% Titon X-100, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 30 mM Na4P2O7, 10% glicerolo, 1 mM benzamidine, 1 mM dithiothreitol, 10 mg/l leopeptina, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (tutti ottenuti da SIGMA). Dopo la lisi cellulare, il sovranatante verrà centifugato a 15000g per 15 minuti a 4°C. La concentrazione delle proteine verrà stimata usando il kit Protein Assay della Bio-Rad (Germania) utilizzando il metodo Bredford. Le proteine totali verranno separate su un gel al 10% SDS-PAGE e trasferite elettroforeticamente su una membrana Immobilon-P (Amersham, UK). Verrà effettuato il test di Ponceau S per confermare l'avvenuto trasferimento delle proteine dal gel alla membrana. Le membrane verranno saturate overnigth a 4°C in TBST (5% nonfat dry milk in 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, e 0.1 Tween-20, pH 7.6). Successivamente i filtri verranno incubati a temperatura ambiente con gli anticorpi specifici per T-bet, GATA 3 e la forma fosforilata delle STATs: p-STAT1, p-STAT4 e p-STAT6 per due ore, successivamente incubate con gli anticorpi HPR-coniugati per 1 ora diluiti 1/3000 (Santa Cruz Biotechnology). Per la rilevazione verrà utilizzato il kit ECL a detezione chemiluminescente (Santa Cruz Biotechnology). Dopo l'analisi dei livelli della forma fosforilata di STAT 1, STAT 4 e STAT 6, i blots verranno strippati e incubati con gli anticorpi che legano la forma totale di STAT 1, STAT 4 e STAT 6 seguita dall'incubazione con gli anticorpi HPR-coniugati e la rilevazione ECL. Un protocollo simile verrà utilizzato per stimare i livelli di COX-2 da proteine estratte da biopsie gastriche "a fresco". Estrazione di RNA, preparazione del cDNA e RT-PCR L'RNA totale verrà estratto secondo il metodo Chomczynski e Sacchi e quantizzato ad una assorbanza di 260nm. L'integrità dell'estratto verrà verificata tramite elettroforesi su gel all'1.5% di agarosio. Il cDNA sarà sintetizzato da 0.5-1 microg di RNA totale utilizzando 0.2 U di murine leukemia virus reverse transcriptase ( Promega, Madison, WI, USA), 2.5 mM random esameri (Boehringer-Mannheim, Germania), 1 mM dNTP (Boehringer-Mannheim), 2 U inibitori RNasi (Promega, USA) il tutto in un volume di 20 microL. La reazione verrà condotta a 37° per 60 minuti. Prima di esaminare i trascritti per IL-12Rbeta2 e COX-2, i campioni di cDNA verranno normalizzati per beta-actina. Varie aliquote di cDNA verranno utilizzate per una reazione di PCR per 19, 20, 21, 22 e 23 cicli con i primers specifici per beta-actina. I primers di IL-12Rbeta2 e COX-2 verranno saggiati in ogni campione incubando un uguale quantitativo di cDNA per 35 cicli. Le reazioni di PCR verranno condotte in un volume totale di 50 microL in presenza di 1 U di Taq DNA polimerasi (Boehringer-Mannheim, Germania), 200 mM dNTPs (Boehringer-Mannheim, Germania) e 25 pmol/L di primers 5' e 3'. La reazione sarà effettuata in un Robocycle Thermal Cycler (Stratagene, CA, USA) (denaturazione 1 minuto a 94°C, annealing per 1 minuto a 55°C ed estensione per 1 minuto a 72°C). I primers utilizzati per la PCR sono i seguenti: beta-actina, 5'-CGAGGCCCAGAGCAAGAGA-3' e 3'-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTG-5'; COX-2, 5'-CAGCAGTTCACGCAT-3' e 3'-TCTGGTCAATGGAAGCCTGT-5'; IL-12Rbeta2, 5'-GGATGCTCATTGGCATTTAT-3'e 3'-TTGTCTGCAAACTGGCCTG-5'. I livelli dei trascritti di RNA saranno valutati mediante computer densitometry (NIH Image software). ELISA Un kit ELISA (R&D System, Minneapolis, MN, USA) verrà utilizzato per valutare i livelli di IL-12, IFN-gamma e IL-4. Tutti i campioni verranno saggiati in duplicato. I risultati verranno espressi in picogrammi per milligrammo (pg/mg) di proteine totali.