RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

MECCANISMI MOLECOLARI DI CHEMIOPREVENZIONE E CHEMIORESISTENZA NELLA CARCINOGENESI GASTRICA CORRELATA ALL'INFEZIONE DA HELICOBACTER PYLORI

Università di riferimento

Università degli Studi di PALERMO - DISCIPLINE CHIRURGICHE ED ONCOLOGICHE - PALERMO(PA)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Gianni PANTUSO

Descrizione

L'unità di ricerca si propone di sottoporre i pazienti affetti da GC prima dell'intervento chirurgico (gruppo A) ad un trattamento farmacologico a base di basse dosi di aspirina, rofecoxib o placebo (come approvato dal Comitato Etico delle diverse Università e dopo aver ottentuto il consenso informato da ciascun paziente) e di ottenere un prelievo ematico da ciascun paziente subito prima e 5 giorni dopo questo trattamento. Tale prelievo sarà utilizzato dall'unità di ricerca dell'Università di Chieti. L'unità ha a disposizione una banca biologica, composta da campioni di tessuto congelato (tumore primitivo e mucosa istologicamente sana) raccolto da 100 pazienti, con almeno 5 anni di follow-up, che sono stati sottoposti a resezione chirurgica potenzialmente curativa per carcinoma gastrico. In questi due anni l'unità di ricerca si propone di caratterizzare dal punto di visto biomolecolare i GC (gruppo B) allo scopo di identificare nuovi indicatori che possano influenzare la progressione tumorale, la risposta al trattamento chemioterapico, e quindi la ripresa di malattia e la sopravvivenza globale dei pazienti. Ulteriori obiettivi del nostro lavoro saranno: - Valutare i livelli di espressione proteica di COX-2, di Pg-p e MRP sia in casi di carcinoma gastrico che nella corrispettiva mucosa sana; - Valutare lo stato mutazionale di K-ras e p53 nei casi di carcinoma gastrico al fine di determinare una possibile correlazione con variazione dei livelli di espressione di Cox-2. - Valutare i differenti profili d'espressione genica correlati con l'espressione di COX-2, Pg-p e/o MRP. - Valutare i livelli di espressione di Pg-p in seguito alla metilazione del promotore di COX-2 - verificare se anche a livello gastrico esiste una relazione tra l'ipermetilazone di COX-2 e l'MSI. L'analisi dell'MSI sarà condotta in collaborazione con l'Unità Operativa di Chieti. Inoltre, nel sottogruppo di pazienti operati per GC e sottoposti a protocolli standard di chemioterapia (gruppo C) verrà anche valutato il livello di espressione di COX-2, di Pg-p e di MRP su sangue periferico prelevato in fase di pre- e post-trattamento farmacologico allo scopo di valutare il loro possibile effetto sul trattamento chemioterapico. Materiali e metodi. Caratteristiche dei pazienti. Selezione dei pazienti a) Criteri di inclusione: diagnosi di adenocarcinoma gastrico (CG) confermata istologicamente (stadi I-IV TNM); Pazienti sottoposti ad intervento chirurgico radicale senza localizzazione a distanza con margini di resezione istologicamente negativi per infiltrazione neoplastica; età minore o uguale a 75 anni; PS ³ 70 IK. b) Criteri di esclusione: precedente (entro 5 anni) o concomitante altra neoplasia maligna; chemioterapia preoperatoria o radioterapia; severa complicanza intraoperatoria; difficoltà ad assicurare un adeguato trattamento o follow-up. Parametri diagnostici pre-trattamento. Storia clinica, esame obiettivo, performance status e tutti gli esami di laboratorio e strumentali per escludere qualsiasi sospetto clinico di malattia. Etica. Consenso informato scritto e testimoniato. Follow up. Esame clinico ogni tre mesi per i primi due anni, successivamente ogni sei mesi fino al quinto anno e successivamente una volta l'anno. Schema di protocollo. I pazienti eleggibili, dopo laparotomia, verranno sottoposti ad esplorazione chirurgica completa dei visceri addominali e ad ecografia intraoperatoria sistematica del fegato e delle ovaie per una più precisa stadiazione. Sarà prevista una resezione curativa e una asportazione estensiva dei linfonodi regionali. Il GC e i linfonodi regionali verranno esaminati dal punto di vista patologico e saranno studiati in accordo con l'ultima classificazione TNM. Le sezioni istologiche verranno esaminate da due distinti patologi dell'unità di ricerca. I tumori saranno classificati secondo i criteri di Lauren in intestinali e diffusi. Sarà valutato anche il grado di differenziazione come G1, G2, G3 (rispettivamente ben-, moderatamente- e scarsamente differenziato). Per ciascun paziente al momento dell'intervento chirurgico, sarà disponibile un questionario standardizzato con informazioni riguardanti più di 100 variabili clinicopatologiche e biologiche, registrato su un database computerizzato. La storia familiare sarà ottenuta in ogni caso, nessuno dei pazienti con storia familiare sarà incluso nel presente studio. I pazienti con linfonodi positivi, entro 5 settimane dall'intervento chirurgico, verranno sottoposti a chemioterapia a base di inibitori delle COX-2. L'intero pezzo asportato verrà sempre studiato dall' anatomopatologo per la stadiazione post-chirurgica. Per garantire un' alta sensibilità dell' esame ed al fine di ottenere una quantità rappresentativa dell' intero tumore, saranno eseguiti prelievi multipli, entro 30 min. dalla exeresi chirurgica, da almeno 5 aree diverse della massa tumorale primitiva, evitando le zone macroscopicamente non vitali; inoltre, prelievi multipli di mucosa sana (conferma istologica) saranno effettuati alla maggiore distanza possibile dal tumore ed utilizzati come standard di riferimento. Tutti i tessuti saranno dissezionati a metà: una metà sarà utilizzata per le indagini patologiche, la rimanente metà sarà rapidamente congelata in azoto liquido e successivamente conservata a -80 °C per le successive analisi biomolecolari. Presso l'Istituto di Anatomia patologica, verranno condotte diverse sezioni seriali mediante microtomo congelatore. Ogni sezione posta su vetrino portaoggetti verrà quindi sottoposta a microdissezione laser microscopicamente guidata allo scopo di eliminare le variabili legate alla presenza di popolazioni eterogenee di cellule. Metodologie biomolecolari A) Analisi del ruolo di COX-2 come marcatore nella progressione del carcinoma gastrico. L'analisi verrà condotta valutando la variazione dei livelli d'espressione del prodotto proteico mediante immunoistochimica su Tissue-Array. B) Analisi dei livelli proteici di Pg-p e MRP. Tale analisi sarà condotta attraverso la tecnica immunoistochimica su Tissue Array. C)Analisi dello stato mutazionale di K-ras e p53. D) Analisi dei differenti profili genetici. Tale analisi verrà condotta attraverso la tecnica dei Microarry Systems al fine di identificare geni specifici coinvolti nella risposta al trattamento farmacologico. E) Analisi dello stato di metilazione del promotore di COX-2 tramite methylation specific PCR F) MSI sarà inizialmente valutata su cinque (D1S158, D2S123, D5S421, D5S346, D17S261, and D8S199) e succesivamente su quattro repeats mononucleotidici (BAT25, BAT26, BAT40 BAT-RII) Analisi statistica. Le variabili clinicopatologiche includono: sesso, età, tipo di trattamento chirurgico, sede (cardia o fundus, corpus et antrum), dimensioni del tumore (< 5 cm e >5 cm), grading istologico (G1, G2 e G3), grado di invasione, istotipo sec. Lauren (intestinale e diffuso), stato linfonodale, stadiazione TNM. Le associazioni tra le variabili biomolecolari e quelle clinicopatologiche verranno valutate mediante il test del Chi-quadro e, dove richiesto, con il test di Yates. L'intervallo libero da malattia sarà calcolato dalla data dell'intervento chirurgico alla data della prima ricaduta (locoregionale o a distanza) e la sopravvivenza dalla data dell'intervento chirurgico alla data di morte per tumore. In assenza di ricaduta o morte i pazienti saranno valutati in base al momento del loro ultimo follow up. Le variabili clinicopatologiche e biomolecolari saranno esaminate con analisi univariata mediante il metodo di Kaplan-Meier. La significatività di tutte le variabili prognostiche verrà valutata con il test di Wilcoxon o con trend tests. L'analisi multivariate sarà effettuata utilizzando il modello di Cox. Per le variabili che contribuiscono in maniera significativa al modello gli effetti saranno calcolati in termini RR e con un CL del 95%. Saranno considerati statisticamente significativi valori di p < 0.05. Descrizione del lavoro dell'unità di ricerca. Primo anno. 1) Ampliamento della banca tissutale con il reclutamento di almeno 40 pazienti. Tale banca verrà messa a disposizione di tutte le Unità di ricerca facenti parte del progetto; 2) Aggiornamento del follow up di tutti i pazienti inclusi nello studio, 3) Classificazione clinicopatologica di tutti i nuovi casi reclutati, 4)Reclutamento dei campioni di sangue di pazienti sottoposti ad un trattamento farmacologico a base di basse dosi di aspirina, rofecoxib o placebo, 5)Classificazione biomolecolare: analisi dei livelli di espressione proteica di COX-2, Pg-p, MRP, e analisi mutazionale dei geni k-ras e p53, di almeno il 50% dei casi già disponibili nella banca tissutale e dei nuovi casi reclutati; 5) Parziale analisi dei risultati ottenuti, in particolare delle relazioni tra le variabili clinicopatologiche e biomolecolari considerate, 6) Trasferimento dei dati clinicopatologici, biomolecolari e del follow-up insieme a quelli riguardanti la risposta alla chemioterapia (a base di celecoxib), lo stile di vita, le abitudini alimentari, la storia familiare di cancro ed altri fattori di rischio (attraverso un questionario riempito nel corso di un colloquio diretto da un genetista medico, dopo aver firmato un documento di consenso informato) su un database (ciascun soggetto sarà identificato tramite un numero di codice). Secondo anno. 1) Implementazione della banca biologica con il reclutamento di almeno altri 40 pazienti da includere nello studio, 2) Classificazione clinicopatologica di tutti i nuovi casi reclutati, 3) Aggiornamento del follow up di tutti i pazienti inclusi nello studio, 4) Classificazione biomolecolare: analisi dei livelli di espressione proteica di COX-2, Pg-p, MRP e analisi mutazionale dei geni k-ras e p53, di tutti i casi reclutati nella banca biologica, 5) analisi dello stato di metilazione del promotore del gene COX-2 ed effetti sull'espressione della proteina Pg-p, 6) Studio sull'instabilità dei microsatelliti e verifica della relazione tra la metilazione del promotore del gene Cox-2 ed MSI, 7) Valutazione dell'attendibilità prognostica delle variabili biomolecolari prese in esame: possibilità di identificare un sottogruppo di pazienti con GC a più alto rischio di ripresa di malattia, 6) Verifica se gli indicatori biomolecolari in studio sono variabili prognostiche indipendenti allo scopo anche di valutare il loro potenziale uso combinato con le variabili clinicopatologiche tradizionali, 8) analisi dei profili d'espressione genica in pazienti sottoposti a trattamento chemioterapico per identificare un pattern di geni specifici coinvolti nella risposta agli inibitori delle COX2.