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L'obiettivo a lungo termine dell'Unità di Ricerca è quello di definire basi biologiche e strategie di impiego clinico degli inibitori selettivi delle ciclo-ossigenasi nella prevenzione e nel trattamento della gastrite cronica e del cancro gastrico. Gli obiettivi intermedi sono: a) definire la farmacodinamica delle risposte al trattamento con rofecoxib ed aspirina in pazienti con gastrite cronica e con carcinoma gastrico; b) definire basi biologiche di variabilita' farmacodinamica; c) identificare bersagli molecolari a valle o a monte dell'inibizione delle COX rilevanti per la risposta clinica nella mucosa e nel cancro gastrico. Per raggiungere questi obiettivi integreremo approcci clinici, genetici, biochimici, e proteomici messi a punto presso il Centro di Studi sull'Invecchiamento (Ce.S.I) in collaborazione con la Prof. Paola Patrignani, la cui competenza nella farmacologia clinica degli eicosanoidi è riconosciuta in campo internazionale. Questa ricerca si articolerà in 4 fasi. Fase 1: reclutamento e trattamento: pazienti sottoposti ad endoscopia digestiva saranno reclutati presso le unita' di Chieti, Napoli, Palermo e Bologna (vedi anche rispettivi programmi) e distinti in pazienti con gastrite Hp correlata, con e senza metaplasia intestinale o displasia (n=100), soggetti Hp negativi (n=100) e pazienti con carcinoma gastrico (n=50). In tutti saranno ottenuti campioni di sangue ed effettuate 3 coppie di biopsie nell'antro e 3 coppie di biopsie nel corpo-fondo gastrico; per i pazienti con cancro gastrico verranno pure ottenute 3 coppie di biopsie di tumore. Una di ciascuna coppia di biopsie sarà congelata in azoto liquido per analisi biochimico-molecolari, l'altra inclusa in paraffina per studi immunoistologici. In tutti i casi verrà effettuata ricerca e tipizzazione dei ceppi di H. pylori (cagA, vacA, iceA) per successiva verifica di correlazioni tra fattori di virulenza, alterazioni biochimico-molecolari e risposta farmacologica. Tutti i pazienti saranno caratterizzati per polimorfismi di COX-1, COX-2 e MDR-1. Dopo aver ottenuto approvazione del protocollo da parte del comitato etico e consenso informato, a tutti i pazienti volontari saranno somministrate basse dosi di aspirina (75 mg/die), rofecoxib (25 mg/die) o placebo per 5 giorni consecutivi, assegnate in modo randomizzato. I livelli plasmatici di aspirina e rofecoxib saranno valutati per verificare variabilità farmacocinetica. Al termine trattamento i pazienti con gastrite e i controlli sani saranno sottoposti a prelievi di sangue ed eventuali campionamenti bioptici come sopra od operatori. Fase 2: analisi della variabilita' farmacodinamica. Per determinare la variabilità farmacodinamica ai trattamenti con rofecoxib o aspirina saranno valutati: a) effetti inibitori sull'attività della COX-2 indotta dall'LPS in monociti del sangue e sull'attività della COX-1 costitutivamente espressa nelle piastrine del sangue periferico; b) biosintesi di citochine e chemochine; c) effetti inibitori su produzione di prostanoidi, citochine e chemochine in campioni bioptici gastrici (mucosa, tumore); d) espressione di mRNA di COX-2, COX-1 e varianti, PGE sintasi (mPGES1, mPGES2, cPGES), PGD sintasi e isoforme del recettore di PGE2 (EP1, EP2, EP3, EP4) nei campioni bioptici. e) campioni bioptici, ottenuti prima e dopo il trattamento farmacologico, saranno inviati all'Unità Operativa diretta dal Prof. Luzza, sui quali, dopo estrazione proteica, si valuterà l'espressione dei fattori di trascrizione STAT 1, STAT 4, STAT 6, T-bet e GATA 3 mediante Western Blotting. Fase 3: definizione delle basi biologiche della variabilita' farmacodinamica. In questa fase del progetto il grado di attività cicloossigenasica ex-vivo ed in vivo e l'espressione delle isoforme della COX saranno correlate con alterazioni molecolari implicate nella cancerogenesi gastrica tra cui: a) livelli di espressione di P-gp e BCL2; b) livelli di metilazione dei promotori di COX-2 e del gene mdr che codifica P-gp; c) alterazioni di geni che potrebbero essere coinvolti nella up-regolazione dell'espressione della COX-2 (APC, ras, p53, diacilglicerolo chinasi, beta-catenina) o nella risposta apoptotica (Bax); d) presenza di instabilita' genomica a livello cromosomico e/o di sequenze ripetitive semplici, indicativa di progressione neoplastica. Inoltre isoforme proteiche della via di biosintesi dei prostanoidi e dei recettori EP, delle citochine e dei loro recettori saranno caratterizzate con un approccio proteomico per definire le basi biochimico-molecolari di eventuali differenze nella risposta farmacologica. Forme varianti di COX-1 e -2 saranno clonate nel baculovirus vettore pBlueBac 4.5/V5-His e l'effetto inibitorio di rofecoxib e di aspirina verso queste forme varianti espresse in cellule Sf9 verrà valutato in vitro. Fase 4: sviluppo di modelli in vitro per identificare bersagli molecolari a valle o a monte dell'inibizione delle cox rilevanti per la risposta clinica. P-gp rimuove molti composti tossici dalle cellule e rappresenta uno dei meccanismi più importanti responsabili di insuccesso chemioterapeutico nel cancro (46). In questa fase investigheremo se l'induzione di P-gp, dipendente da COX-2 (47), possa essere coinvolta nella resistenza all'apoptosi, come nel cancro del colon dove l'iperespressione di COX-2 induce resistenza a stimoli apoptotici, revertibile dai FANS (13). Ipotizziamo che P-gp indotta in risposta a COX-2 partecipi al fenomeno di resistenza all'apoptosi attraverso l'efflusso di composti apoptotici quali la ceramide. Per verificare questa ipotesi intendiamo subclonare cDNA di COX-2 nel vettore ricombinante adenovirale MSCV che verra' usato per infettare la linea cellulare di cancro del colon HT-15, non esprimente COX-2. La real-time PCR permetterà di quantizzare l'espressione del gene MDR nelle HT-15 trasfettate e l'analisi Western-blot permetterà di determinare il prodotto post-trascrizionale. Una eventuale aumentata resistenza delle HT-15 trasfettate agli stimoli apoptotici sarà determinata valutando l'attività della caspasi 3 e l'espressione di Bcl-2. Infine, l'inibizione dei prostanoidi da parte di rofecoxib e di FANS non selettivi (indometacina ed aspirina) nelle cellule trasfettate con COX-2 verrà correlata ai livelli di espressione di P-gp, di Bcl-2 e con l'attività di caspasi 3. Metodi Aliquote da 1-ml di sangue eparinizzato prelevato prima e dopo trattamento con rofecoxib, aspirina, o placebo saranno incubate a 37°C per 24 h in presenza di LPS (10 microg/ml). Altre aliquote da 1-ml di sangue intero dagli stessi pazienti saranno lasciate coagulare a 37°C per 1h. Il plasma e il siero saranno separati per centrifugazione e conservati a -80 °C fino alla misurazione di PGE2 e TXB2 come descritto (47,48) e di citochine (IL-1beta, IL-18, IL-10, TNFalfa, etc) tramite kit ELISA commercialmente disponibili (R&D). I campioni di mucosa e/o tumore gastrico congelati in azoto liquido per la valutazione dei livelli di prostanoidi saranno omogenizzati in etanolo al 70%. Dopo centrifugazione, il sovranatante sarà recuperato, portato a secco, quindi il residuo sarà recuperato e purificato con colonnine Sep-Pak C18 (Waters Associates) ed eluito con etil acetato. Gli eluati saranno portati a secco e recuperati con tampone fosfato (pH 7.4, 0.02 M) per la valutazione dei livelli di PGE2, PGD2, PGF2a, 6-keto-PGF1a e TXB2 mediante specifiche tecniche radioimmunologiche, e di citochine tramite kit ELISA commercialmente disponibili (R&D). Per i RIA di TXB2, PGE2, PGF2a, 6-keto-PGF1a e PGD2 i campioni saranno diluiti in tampone fosfato 0.02 M, pH 7.4 (1.5 ml). Utilizzeremo 4,000 d.p.m. di [3H]-TXB2, [3H]-PGE2, [3H]-PGF2a, [3H]-6-keto-PGF1a o [3H]-PGD2 (attività specifica>100Ci/mM, NEN TM Life Science Products), standard del TXB2, PGE2, PGF2a,6-keto-PGF1a e PGD2 (Cayman Chemical Company) e anticorpi policlonali contro TXB2, PGE2, 6-keto-PGF1a e PGF2a sviluppati dalla nostra unità (47,48). L'anticorpo anti-PGD2 sarà ottenuto dalla Cayman Chemical Company. L'RNA totale sarà estratto dai campioni congelati come descritto. Un microg. di RNA sarà trascritto in cDNA utilizzando il Kit Omniscript RT (Qiagen, CA) e esameri random invece di primer oligo-dT. I primer saranno scelti in modo da amplificare l'intera regione codificante di COX-2 e COX-1 e possibili varianti, di mPGES1, mPGES2 e cPGES, di PGD sintasi e delle isoforme del recettore di PGE2 (EP1, EP2, EP3 e EP4) in due frammenti sovrapponibili. La beta-actina sarà usata come standard interno. I prodotti della PCR saranno analizzati su gel di agarosio. L'analisi TaqMan del cDNA di COX-2 (10 ml della diluizione 1:100 delle preparazioni primarie) sarà svolta su detector di sequenza ABI prism 7900 (Perkin Elmer, Oak Brook, IL) secondo protocollo standard. Le reazioni saranno corse in volumi totali da 50 microl. Per la real time PCR, l'amplificazione sarà ottenuta con iCycler (Bio-Rad) in 25 µL contenenti: Taq polimerasi, 1x Taq buffer (Stratagene), 125 µM dNTP, SYBR Green I (Molecular Probes), e Fluorosceina (Bio-Rad), usando oligo-dT cDNA o random hexamer cDNA come stampo di PCR. Le condizioni di amplificazione e i primers saranno selezionati con apposito programma. Per il Western-blot i campioni saranno scongelati (in tampone fosfato 50 mM, pH 7.1, NaCl 0.1 M , EDTA 2 mM, fenilmetilsulfonil fluoruro 0.4 mM, inibitore della tripsina 60 microM, leupeptina 2 microM, aprotinina 2 microM, pepstatina 2 microM), disgregati due volte per 15 secondi in ghiaccio, e omogeneizzati per sonicazione a 4°C. I detriti saranno rimossi a 100.000g per 60 min a 4°C. L'immunoblotting sarà effettuato come descritto (47). DNA genomico sarà estratto da sangue congelato e sezioni microdissezionate in paraffina o congelate, come descritto (49,51). Per definire lo status MSI, 3 microsatelliti mononucleotidici e 3 dinucleotidici, i campioni MSI-H saranno poi analizzati per mutazioni in sequenze ripetitive codificanti in TGFbetaRII, IGFIIR, FAS, Bcl10, APAF-1, Caspasi 5, hMSH6, hMSH3, MED1, RAD50, come descritto (50). La presenza di instabilita' cromosomica verra' analizzata tramite arbitrarily primed PCR. Mutazioni in APC (regione MCR nel 5' dell'esone 15), beta-catenina (regione di controllo nell'esone 3), e Bax (intera sequenza codificante) sarannno studiate mediante amplificazione via PCR, screening via DHPLC o sequenza diretta su ABI prism 7700. Per l'instabilità cromosomica, DNA fingerprints saranno generate da DNA del sangue e dei campioni bioptici con i primers arbitrari (AP) MCG1 and Blue (che generano bande a localizzazione cromosomica nota) e le bande AP-PCR che mostrano intensita' differenziale saranno clonate dopo riamplificazione. I frammenti clonati saranno sequenziati e perdite e guadagni cromosomici saranno confermati con tecniche RFLP standard e Southern blot. Per i saggi di metilazione del promotore di COX-2, si amplificherà l'isola CpG e sarà effettuata una PCR metilazione-specifica, usando DNA trattato con sodio bisolfito, che converte le citosine non metilate in uracile (52). Per la caratterizzazione di polimorfismi di COX-1, COX-2 e MDR-1 su DNA da sangue sarà amplificata via PCR la sequenza codificante, compresi i confini introne-esone, e/o le regioni promoter, gli amplificati saranno analizzati via DHPLC e sequenziati su ABI prism 7700. Varianti di COX-1 e COX-2 saranno clonate in vettore baculovirus pBlueBac 4.5/V5-His (Invitrogen). I costrutti saranno utilizzati per trasformare cellule Sf9. Le cellule Sf9 esprimenti varianti di COX-1 e COX-2 saranno messe in coltura, le frazioni microsomiali saranno preparate, per valutare gli effetti inibitori del rofecoxib e dell'aspirina. Dopo pre-incubazione con concentrazioni crescenti dei due farmaci per 30 min, 0.5-10 microM di [14C] acido arachidonico sarà addizionato alle membrane microsomiali per 15 min. I prodotti radioattivi saranno estratti con colonnine Sep-Pak C18 (Waters Associates) ed eluiti con 10 ml di etil acetato. Dopo evaporazione, gli estratti saranno ricostituiti con 200 microl di metanolo/acqua (1/1, vol/vol), iniettati in colonna Nova-Pak C-18 di un sistema Beckman System Gold HPLC con detector per radioisotopi, ed eluiti con acetonitrile-acqua-acido acetico glaciale (23:77:0.1 v/v) alla velocità di flusso 1 ml/min (53). La radioattività che eluisce con i tempi di ritenzione dei prostanoidi standard sarà utilizzata per quantificare l'attività cicloossigenasica. Per l'analisi proteomica delle isoforme della COX e dei recettori EP i tessuti saranno solubilizzati e frazionati via elettroforesi bidimensionale, e le proteine di interesse, visualizzate mediante colorazione in argento, saranno escisse e analizzate mediante spettrometria di massa MALDI-TOF. Per misurare i livelli plasmatici di aspirina e rofecoxib nel plasma campioni di sangue eparinizzato saranno centrifugati per 30 min, e il plasma sarà conservato a -20°C fino all'analisi. I livelli dell'acido acetilsalicilico e del suo metabolita, acido salicilico, saranno valutati come descritto (54). Il farmaco sarà estratto e separato mediante cromatografia in fase inversa [fase mobile: metanolo-acqua (80:100, v/v) acidificato con acido perclorico a pH 2.5]. I livelli plasmatici di rofecoxib saranno valutati come descritto (55). Dopo addizione di standard interno, i campioni tamponati a pH 5 saranno estratti con esano:cloruro di metilene (50:50, vol:vol), evaporati e risospesi in fase mobile (acetonitrile:acqua, 35:65, vol:vol). Dopo esposizione a UV, il rofecoxib reagirà mediante fotociclizzazione con formazione di specie altamente fluorescente. Gli estratti saranno analizzati con HPLC dotata di post colonna di derivatizzazione fotochimica e detector per fluorescenza, a lunghezza di eccitazione di 250nm e di emissione di 375nm. La linea di cancro colorettale HT-15, ottenuta dall'ATCC sarà tenuta in DMEM con FCS al 15%. Per creare il costrutto dell'adenovirus COX-2 ricombinante, l'intero cDNA della COX-2 verrà sottoclonato nel vettore MSCV, resistente alla puromicina. Il costrutto sarà introdotto nella linea cellulare Phoenix. Le cellule HT-15 saranno infettate con supernatanti di Phoenix con il virus. Il trascritto di COX-2 nelle HT-15 trasfettate sarà verificato via "RNase protection assay". L'RNA totale sarà isolato con TRIzol e verrà eseguita RT-PCR con primer per COX-2 e actina. L'RT-PCR per la P-gp sarà eseguita come per COX-2 usando specifici primer. Per Western-blotting le cellule saranno lisate in 50mM Hepes, 150mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10% Glicerolo, 1% triton X-100 ed un cocktail di inibitori delle proteasi. Il contenuto proteico è quantificato con saggio Bradford. I campioni saranno separati su SDS-PAGE (10%). Le proteine saranno trasferite su nitrocellulosa e sondate con appropriati anticorpi policlonali. L'attivazione della caspasi è misurata dopo clivaggio del substrato fluorogenico DEVD-AFC (30microM) usando 100 microgrammi di lisati interi di controllo e trasfettati. I risultati saranno espressi come aumento dell'attività. Per la caratterizzazione di H. pylori si procederà all'analisi della struttura dell'isola di patogenicità usando come marker il gene cagA, all'analisi delle varianti alleliche della regione segnale (s1a, s1b, s2) e della regione intermedia (m1, m2) del gene vacA, ed infine all'analisi delle varianti alleliche (A1, A2) del gene iceA. Il DNA sarà estratto da campioni bioptici mediante QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, CA). L'amplificazione con PCR sarà effettuata con primers disegnati in regioni nucleotidiche conservate. I prodotti di PCR saranno sequenziati con ABI PRISM Big DyeTM Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems).
