RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

ATASSIE CON APRASSIA OCULOMOTORIA: Studio clinico e genetico

Università di riferimento

Universita' degli Studi di ROMA - MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luciana CHESSA

Descrizione

In Italia è attivo dal 1986 il Registro Italiano per l'Atassia Telangiectasia (RIAT) che raccoglie i dati sulle famiglie AT con la collaborazione di clinici e genetisti che lavorano nelle Università e nei grandi ospedali. Il RIAT richiede informazioni sui probandi, come i dati clinici, anamnestici ed i risultati delle analisi di laboratorio, e sulle loro famiglie, insieme ad un accurato albero genealogico. Contemporaneamente al Registro è stata creata una Banca Cellulle, formata principalmente da linee cellulari linfoblastoidi (LCLs), e che rappresenta una fonte continua di materiale biologico. Durante gli anni passati abbiamo raccolto dati e stabilizzato linee cellulari anche da pazienti AT-Varianti, che mostrano il fenotipo neurologico AT ma senza telangiectasie nè coinvolgimento multisistemico e con radiosensibilità normale o poco alterata e nessun incremento dell'alfafetoproteina. Tutti questi pazienti 'varianti' sono stati studiati per il fenotipo AT a livello cellulare (radiosensibilità), molecolare (DHPLC e sequenziamento) e biochimico (Western blot). La scoperta di mutazioni nel gene Mre11 in pazienti con Ataxia Telangiectasia Like Disorders (ATLD) ci ha indotto a produrre un pannelo di anticorpi diretti contro le proteine Mre11, NBS1 e Rad50, da utilizzare per tutti quei pazienti con un fenotipo suggestivo, portando all'identificazione di una nuova, terza fratria con ATLD. Dopo la recente scoperta di mutazioni nel gene APTX in pazienti con AOA1, che presentano un fenotipo neurologico ed un'età di esordio sovrapponibile agli AT, abbiamo deciso di ricercare possibili mutazioni APTX nei nostri pazienti 'varianti' che sono risultati negativi alla ricerca di mutazioni ATM. Anche i pazienti con fenotipo AOA1 identificati dagli altri gruppi afferenti a questa ricerca saranno screenati per mutazioni del gene APTX nel nostro laboratorio. Infine, tutti i pazienti mutati in APTX, così come quelli AOA2 mutati nel gene della senataxina ed identificati dagli altri gruppi, saranno da noi caratterizzati a livello cellulare. Punto 1 - Rivalutazione clinica dei dati del RIAT Tutti i pazienti con fenotipo AT-like negativi per ATM, con atassia e aprassia oculomotoria ma senza telangiectasie e con alfafetoproteina normale saranno studiati per mutazioni di APTX. Risultati preliminari su 10 pazienti 'varianti' ci hanno permesso di identificare 4 pazienti omozigoti per mutazioni di APTX; tre di loro avevano una mutazione già nota (837G>A), il quarto presentava una nuova mutazione nonsense (739C>T). Poichè circa 10 nuovi pazienti vengono inviati ogni anno al Registro ci aspettiamo di trovare nella nostra casistica 20-30 individui mutati nel gene APTX. Punto 2 - Caratterizzazione molecolare e cellulare Ci proponiamo di caratterizzare gli individui affetti sia per gli aspetti molecolari che per il fenotipo cellulare. Le cellule saranno innanzitutto studiate per la loro radiosensibilità attraverso il Colony Surviving Assay (CSA), al fine di escludere la diagnosi di AT. Gli esami citofluorimetrici ci daranno informazioni sulla progressione del ciclo cellulare dopo l'induzione di danno al DNA, mentre lo studio della produzione di foci nucleari da parte di differenti agenti genotossici ci servirà a definire il grado di coinvolgimento del prodotto genico ai siti di rottura del DNA. Anche il comet assay, tecnica molto sensibile per lo studio del danno al DNA, sarà utilizzato per valutare gli effetti degli agenti genotossici nelle cellule difettive. L'analisi di mutazione con DHPLC dei geni ATM, NBS1, Mre11 e APTX permetterà di identificare il difetto genico nella maggioranza dei nostri pazienti. La valutazione del livello proteico nelle cellule mutate da un lato faciliterà l'identificazione dei geni coinvolti e dall'altro fornirà informazioni sullo stato funzionale delle relative proteine. L'uso, sia per Western blotting che per coimmunoprecipitazione, di anticorpi diretti contro substrati, fosforilati o no, si rivelerà essenziale per conoscere lo stato funzionale dei prodotti genici coinvolti. Punto 3 - Stress ossidativo nelle cellule mutate E' stato proposto che il fenotipo di molte sindromi da riparo del DNA possa essere dovuto ad uno stato continuo di stress ossidativo, che porta ad un incremento di morte cellulare programmata o a cambiamenti cellulari che risultano in trasformazione maligna. Nel nostro studio indurremo il danno ossidativo trattando le cellule con camptotecina e bromato di potassio, che inducono rotture a singolo filamento (SSBs). Nell'uomo malattie genetiche associate a difetti nel riparo dei SSBs non erano note fino alla scoperta di mutazioni in un nuovo gene, chiamato apratassina (APTX), associato all'Atassia con Aprassia Oculomotoria di tipo 1 (AOA1) e che produce una elicasi che probabilmente agisce insieme a XRCC1 e PNK per riparare i SSBs. Occore notare che questa malattia appare ristretta al sistema nervoso e non mostra evidenza di aumento dell'instabilità genetica o di cancro. Tale dato appare in accordo con il fatto che si trovano più SSBs da danno ossidativo nel sistema nervoso che in altri tessuti, forse per l'alta energia richiesta da questo sistema. Poichè risultati preliminari hanno mostrato nelle cellule AOA1 ipersensibilità al danno ossidativo, ci proponiamo di studiare l'abilità delle cellule normali e mutate nella risposta al potassio bromato (KBrO3), un carcinogeno renale che induce essenzialmente 8-idrossiguanina (8-oxodG). Il danno ossidativo indotto da questa sostanza differisce da quello indotto da altri agenti ossidanti, come H2O2 e altri perossidi, che agiscono principalmente via radicali idrossilici. Per finire, analizzeremo se lo stress ossidativo indotto da KBrO3 possa condizionare le risposte dei checkpoints G1 e G2 e l'induzione di p53. MATERIALI E METODI Pazienti e linee cellulari difettive nei geni del DNA repair Ad oggi la Banca Cellule del RIAT contiene 105 LCLs di pazienti AT classici più 21 da pazienti AT Varianti, 2 da pazienti NBS e 6 da NBS-like, 2 da pazienti ATLD e 4 da pazienti AOA1, oltre a 18 LCLs stabilizzate da soggetti normali per essere utilizzate come controllo. Le LCLs vengono stabilizzate per incubazione da linfociti B, separati con Ficoll-Hypaque dal sangue periferico, con il supernatante della linea cellulare B95-8, produttrice di EBV. Le linee crescono come popolazioni policlonali in RPMI 1640 supplementato con 15% di siero fetale di vitello, 100U/ml di penicillina, 100mg/ml di streptomicina, 2mmol/l di glutamina a 37°C in 5% CO2. Cinque fialette di ciascuna linea sono conservate in azoto liquido in una soluzione di siero fetale con il 10% di dimetilsulfossido e scongelate quando necessario. Radiosensibilità con CSA Sebbene il CSA sia un test semiquantitativo la sua sensibiltà diagnostica è del 97.2% e la specificità >99%, il che lo rende un test molto affidabile per lo studio della radiosensibilità individuale. Cinque-dieci ml di sangue eparinato vengono prelevati da pazienti difettivi in geni del riparo del DNA dopo firma del consenso informato. I linfociti vengono isolati in gradiente di Ficoll-Hypaque (Pharmacia) e trasformati con virus di Epstein-Barr. Le LCLs sono mantenute in terreno addizionato con 15% di siero fetale bovino (Hyclone) e 1% penicillina/streptomicina (Gibco BRL) a 37oC e 5% CO2. Cellule in fase logaritmica di crescita (1.000.000 cellule/ml) vengono piastrate in doppio in piastre con 96 pozzetti alla concentrazione di 100 o 200 cellule/pozzetto; una piastra viene trattata con 1.0 Gy di radiazione e l'altra viene tenuta come controllo. Le cellule vengono poi incubate per 10-13 giorni e poi colorate con MTT (Sigma). Dopo 2-4 ore di incubazione ciascun pozzetto viene controllato al microscopio; le cellule vitali risulteranno blu scuro e la presenza di una colonia >32 cellule considerata come un pozzetto positivo. Il CFE (colony-forming efficiency) viene calcolato dalla divisione del numero di pozzetti negativi per il numero di cellule piastrate per pozzetto. Nella piastra sono incluse cellule normali e AT rispettivamente come controlli negativo e positivo. Induzione dei Foci nucleari La formazione di specifiche strutture proteiche focali in seguito a danno e' evidenziabile con tecniche di immunofluorescenza utilizzando anticorpi fluorocromo-marcati contro le proteine in studio. In parallelo, sulla stessa linea cellulare difettiva studieremo, con citometria a flusso, i checkpoints del ciclo cellulare coinvolti nella risposta al danno indotto al DNA e nella formazione di lesioni cromatidiche. L'analisi in fibroblasti e LCLs dei foci formati dalle varie proteine nucleari coinvolte nei pathways del riparo del DNA ci indichera' quali siano i geni difettivi coinvolti. La precedente messa a punto di una tecnica che permette l'analisi dei foci nucleari su LCLs aiutera' nel raggiungere rapidamente un risultato sicuro. Le linee cellulari saranno trattate con sostanze genotossiche, fissate, colorate per immunofluorescenza con antisieri policlonali contro NBS1, hMre11, Rad50, Rad51, APTX, H2AX, etc., e controcolorate con Hoechst per controllare l'integrita' nucleare. I vetrini saranno quindi osservati con un fotomicroscopio a fluorescenza. Test delle Comete (Comet assay) Le cellule linfoblastoidi vengono contate, centrifugate e diluite in PBS alla concentrazione finale di 15000 cellule/ml. Dopo il trattamento con l'agente genotossico (radiazioni ionizzanti, acqua ossigenata o altro) le cellule vengono trasferite su un vetrino ben pulito ed osservate con un microscopio a fluorescenza utilizzando i filtri per la rodamina, il DAPI ed il bromuro di etidio. L'immagine della cometa viene acquisita con un software dedicato che permette di analizzare l'entita' del danno. La SCGE (Single cell gel electrophoresis) e' un metodo semplice ed efficace per valutare il danno al DNA nelle cellule trattate; la tecnica si basa sull'abilita' dei frammenti di DNA danneggiato di migrare al di fuori della cellula sotto l'influenza di un campo elettrico, mentre il DNA non danneggiato migra piu' lentamente rimanendo entro i confini del nucleoide. Citofluorimetria L'analisi del ciclo cellulare in cellule esposte ad agenti genotossici viene eseguita utilizzando la citometria a flusso (FCM) durante ed in seguito al trattamento con sostanze genotossiche. I campioni vengono lavati una volta in PBS, fissati in una soluzione al 50% di acetone/metanolo (1:4 v/v) in PBS e conservate a 4°C. 500.000 cellule sono incubate con una soluzione contenente 50 mg/ml di Propidio Ioduro (PI) e 75 KU/ml di RNasi per 30 minuti a temperatura ambiente e al buio. Vengono acquisiti almeno 20.000 eventi/campione (tasso di flusso 100-150 cellule/secondo) utilizzando un modulo di discriminazione doppio (DDM) in un citofluorimetro FACSCalibur (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA USA) ed un Cell Quest software package (Becton Dickinson). Le cellule vengono trattate: a) con radiazioni gamma usando una sorgente di 137Cs che emette una dose media di of 8Gy/minuto; b) con radiazioni UV da 10 a 50 J/m2, seguita da incubazione con 100mM di idrossiurea (HU); o c) con 20 micromoli di H2O2 in PBS per 1 ora; infine raccolte a vari tempi dopo il trattamento. Stress ossidativo indotto da potassio bromato e camptotecina Linee linfoblastoidi normali e difettive, caratterizzate per differenti mutazioni, saranno trattate come una popolazione cellulare asincrona con varie dosi di potassio bromato (KBrO3) o camptotecina e analizzate per la presenza di danno cromosomico e di rottura del DNA, che e' indicativo dell' accumulo di intermedi del riparo da incisione delle lesioni primarie al DNA, come (8-oxodG) o SSBs. L'induzione di lesioni primarie al DNA, come (8-oxodG), e la loro evoluzione dopo il riparo al DNA saranno monitorate, nelle linee normali e mutate, per mezzo del comet assay in combinazione con la formamidopirimidina-DNA glicosilasi batterica (proteina Fpg) che rimuove specificamente la 8-idrossiguanina. Per monitorare i checkpoints del ciclo cellulare e l'induzione di p53 si utilizzera' la citofluorimetria a flusso. DHPLC e Sequenziamento La DHPLC e' una tecnica molto sensibile per identificare nuove mutazioni o polimorfismi attraverso l'esposizione di prodotti di PCR non purificati a cromatografia a fase inversa. Sotto condizioni di parziale denaturazione al calore in un gradiente lineare di acetonitrile, gli eteroduplex formatisi nei campioni di PCR in conseguenza della variazione di sequenza mostrano un ritardo nella ritenzione della colonna rispetto agli omoduplex. I profili di eluizione di questi campioni sono distinti da quelli che hanno una sequenza omozigote, rendendo l'identificazione dei campioni che portano polimorfismi o mutazioni una procedura relativamente semplice. La DHPLC sara' eseguita su un sistema WAVE di analisi dei frammenti di DNA utilizzando una colonna DNAsep (Transgenomic, Crewe,UK). I DNA genomici isolati dalle linee linfoblastoidi di pazienti e controlli saranno amplificati mediante PCR in 30ml di volumi di reazione, contenente ciascuno 50ng di DNA genomico, 25 pmol di ciascun primer, 0.2mM di dNTP e 2U di polimerasi Optimase (Transgenomic). 5-8 ml di ciascun prodotto di PCR saranno denaturati a 95°C per 5 minuti, quindi gradualmente rianellati a temperatura ambiente per 30 minuti. I prodotti di PCR saranno poi separati attraverso un gradiente lineare di acetonitrile al 2% al flusso di 0.9 ml/min. La fase mobile della colonna consistera' di una miscela di trietilamina acetato 0.1M (pH 7.0) con (buffer B) o senza (buffer A) il 25% di acetonitrile. Le molecole di DNA eluite dalle colonne saranno evidenziate per scanning con un UV-C detector. I prodotti di PCR che mostreranno un pattern eterozigote saranno purificati e quindi sequenziati con un analizzatore genomico ABI Prism 3100 (Applied Biosystem). Western blotting I livelli di espressione delle proteine ATM, NBS1, Mre11, Rad50 e APTX saranno determinati per western blotting utilizzando anticorpi commerciali monoclonali o policlonali e normalizzando con anticorpo anti-beta-actina. Le cellule, trattate o non trattate, saranno lavate con tampone PBS addizionato di 0.1 mM Na3VO4 (Sigma), pellettate e lisate in tampone Laemmli (0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 5%SDS) contenente come inibitori 1mM di PMSF, 10mg/ml di pepstatina, 100KIU/ml di aprotinina, 10mg/ml di leupeptina e 1mM di Na3VO4. I lisati saranno bolliti per 2 minuti, sonicati e quantizzati con metodo micro-BCA. Aliquote contenenti 40mg/ml di proteina e 5% di beta-mercaptoetanolo saranno frazionate su SDS-PAGE al 7-10% e blottate su membrane PVDF. Dopo il blocco del processo con latte in polvere non grasso al 5% in PBS piu' Tween 0.1%, le membrane saranno incubate con anticorpi specifici ed in seguito con una perossidasi coniugata a un anticorpo secondario. Le bande di immunoreazione saranno visualizzate su films autoradiografici mediante segnali ECL; le bande autoradiografiche saranno analizzate per densitometria ottica utilizzando un Fluor-S MultiImager. Coimmunoprecipitazione Le cellule sono lisate per 30' in tampone freddo contenente 50 mM di Tris-HCl a pH 7.4, 0.2% di Triton X-100, 0.3% di NP-40, 150mM di NaCl, 1mM di PMSF, 1mg/ml di pepstatina, 2mg/ml di leupeptina, 2mg/ml di aprotinina, 25mM di NaF, 1mM di EDTA, 1mM di Na3VO4. I lisati chiarificati sono poi pretrattati per 10' a 4°C con 10 ml di proteina A immobilizzata e immunoprecipitati con 5 mg di anticorpo da solo o coimmunoprecipitato con substrato e 10 ml di proteina A immobilizzata a 4°C per 2 ore. L'attivita' proteica viene determinata a 30°C per 30' in 20 ml di una miscela di reazione contenente 50 mM HEPES a pH 8.0, 10mM MgCl2, 2.5mM EDTA, 1mM ditiotreitolo, 10mM a-glicerofosfato, 1mM NaF, 0.1mM Na3VO4, 0.1 PMSF, 10mM ATP e 30 mCi g-32P e, quando necessario, un substrato appropriato. I prodotti di reazione saranno separati su SDS-PAGE e le proteine rilevate mediante autoradiografia.