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Questo progetto di ricerca si propone di analizzare i meccanismi alla base delle funzioni regolatorie ed effettrici (citotossica) delle cellule NK. In particolare studieremo: a) Gli eventi di trasduzione prossimali a recettori attivatori e di adesione che controllano l'attivazione della funzione citotossica delle cellule NK ed il ruolo delle GTPasi Cdc42 ed Arf6 coinvolte nei processi di riorganizzazione del citoscheletro ed esocitosi dei granuli. b) L'endocitosi come meccanismo di regolazione dell'espressione dei recettori attivatori NK e di spegnimento del segnale. c) La regolazione delle risposte dei linfociti T da parte delle cellule NK con particolare attenzione all'identificazione delle coppie recettori/ligandi che stimolano la proliferazione e la produzione di citochine da parte di linfociti T o la lisi dei linfociti T attivati. OBIETTIVO 1. Analisi degli eventi intracellulari innescati da recettori NK attivatori e dalle integrine e della loro rilevanza nell'attività citotossica naturale. In particolare ci proponiamo di studiare: 1A) Ruolo dell'attivazione di Pyk2 come evento discriminatorio tra i segnali prossimali generati da recettori attivatori contenenenti o non contenenti sequenze ITAM, e dalle integrine beta 2. Abbiamo dimostrato che l'attivazione della tirosino chinasi Pyk2 è coinvolta nella citotossicità naturale, ma non mediata dal CD16. L'attivazione di Pyk-2 è anche indotta dalle integrine beta 2, e da alcuni recettori attivatori NK che non contengono sequenze ITAM, quali il CD244, e il CD69 (Gismondi et al. risultati preliminari). Per analizzare più a fondo il ruolo di Pyk2 nella citotossicità naturale, estenderemo lo studio sia ad altri recettori attivatori che contengono motivi ITAM (come il CD16) ed in particolare quelli della famiglia NCR (NKp46, e NKp 44) identificati dai gruppi Moretta, sia ad altri recettori privi di ITAM quali l'NKG2D. L'attivazione di Pyk2 sarà valutata in cellule NK stimolate mediante anticorpi monoclonali specifici, o dove possibile cellule trasfettate con i ligandi dei recettori attivatori, mediante immunoprecipitazione, western blot e saggio chinasico. Il contributo dei recettori attivatori NK vs le integrine beta2 sarà invece analizzato utilizzando cellule NK di pazienti LAD con deficit di integrine beta2 in collaborazione con il Prof. Luigi Notarangelo, Università di Brescia. 1B) Analisi degli eventi di segnalazione che associano Pyk2 ai recettori attivatori NK (NKG2D, CD244) e alle integrine beta 2. E' noto che le tirosino chinasi della famiglia Src possono regolare la citotossicità NK; tuttavia il ruolo selettivo di varie chinasi Src (es. Fyn vs Lck) non è stato esplorato, né è stata studiata l'interdipendenza tra Pyk2 e le chinasi Src nelle cellule NK stimolate dalle integrine beta2 o dai recettori attivatori. Affronteremo quindi questa problematica utilizzando inibitori farmacologici specifici per le chinasi Src o virus vaccinici ricombinanti che codificano per forme wild-type o mutate di specifiche chinasi. Per quanto concerne il recettore CD244 che associa SAP, una proteina in grado di reclutare selettivamente Fyn al recettore SLAM nei linfociti T, esamineremo il ruolo relativo di Fyn vs Pyk2 nell'indurre la fosforilazione in tirosina del recettore e il reclutamento di SAP, mediante overespressione di forme dominanti negative delle due chinasi in cellule NK stimolate da parte del CD244. In collaborazione con il Prof. Notarangelo valuteremo inoltre l'attivazione di Pyk2 nelle cellule NK di pazienti con la malattia linfoproliferativa associata al cromosoma X che presentano mutazioni di SAP e una ridotta citotossicità NK nei confronti di cellule bersaglio EBV+. OBIETTIVO 2. Analisi del ruolo di "small G proteins" nella citotossicità mediata dalle cellule NK. Il legame delle cellule NK alle cellule bersaglio induce una rapida riorganizzazione del citoscheletro di actina, la polarizzazione dei granuli litici e la formazione di una sinapsi citolitica dove ha luogo l'esocitosi dei granuli. Nonostante non si conoscano molti elementi che controllano il riarrangiamento del citoscheletro e la degranulazione, è sempre più evidente il ruolo di proteine ad attività GTPasica delle famiglie Rho (Rac, Cdc42) ed Arf. 2A). Ruolo del pathway Cdc42/WASP nelle funzioni citotossiche delle cellule NK. In collaborazione con il Prof. Notarangelo abbiamo recentemente dimostrato il ruolo di Cdc42/WASP nel controllo dell'attività citotossica NK utilizzando cellule NK di pazienti con sindrome di Wiscott-Aldrich (WAS) o trombocitopenia legata al cromosoma X, che presentano mutazioni di WASP, un gene che codifica per una molecola della famiglia SCAR/WAVE in grado di regolare il citoscheletro di actina (Gismondi et al. Blood 2004, in press). Abbiamo inoltre osservato che l'interazione delle cellule NK con cellule bersaglio suscettibili alla lisi e la stimolazione del CD16 o delle integrine beta 2 inducono rispettivamente l'attivazione di Cdc42 e la fosforilazione in tirosina di WASP. Questi due eventi di segnalazione attivano in maniera cooperativa la funzione di WASP. Dati in letteratura indicano inoltre che WASP è anche regolato da WIP (WASP-Interacting Protein) una proteina responsabile del reclutamento di WASP alla membrana plasmatica. Il nostro studio ha inoltre messo in evidenza che i difetti funzionali delle cellule NK nei pazienti WAS sono corretti dal trattamento con IL-2. Ci proponiamo quindi di studiare sia i meccanismi che regolano la funzione di Cdc42/WASP nelle cellule NK sia quelli che sono alla base della capacità dell'IL-2 di ripristinare la funzionalità delle cellule NK nei pazienti WAS. In particolare, analizzeremo se l'interazione delle cellule NK con differenti cellule bersaglio o la stimolazione di recettori attivatori quali il CD16, l'NKG2D o il CD244, o le integrine beta 2 inducano l'attivazione di Cdc42 e/o la fosforilazione in tirosina di WASP. L'attivazione di Cdc42 sarà analizzata mediante esperimenti di precipitazione per affinità usando la proteina di fusione GST-PAK. Il ruolo di Cdc42 nella citotossicità NK e nell'attivazione di WASP sarà determinato saggiando l'attività citotossica e l'accumulo di F-actina in cellule NK stimolate, dopo infezione con virus vaccinici ricombinanti che codificano per le forme wild-type o mutate di Cdc42. Verrà inoltre analizzata la fosforilazione in tirosina di WASP mediante immunoprecipitazione e Western blot con anticorpi specifici; cercheremo di identificare le tirosino chinasi coinvolte in questo evento con particolare attenzione a Pyk2 o membri della famiglia Src, valutando la co-immunoprecipitazione di tirosino chinasi con WASP e lo stato di fosforilazione di WASP in cellule trattate con inibitori delle chinasi Src o infettate con virus vaccinici che codificano per forme wild-type o mutanti di specifiche tirosino chinasi. Tramite l'utilizzo di inibitori specifici, analizzeremo inoltre il ruolo di enzimi PKC (in particolare alpha e theta) nella modulazione della funzione di WASP, in quanto la PKC theta è in grado di fosforilare WASP e l'attivazione della PKC alpha è un evento a monte della PKC theta e richiesto per la citotossicità NK verso determinate cellule bersaglio. Per comprendere i meccanismi alla base della capacità dell'IL-2 di correggere i difetti funzionali delle cellule NK in pazienti WAS, analizzeremo l'espressione di altri membri della famiglia WASP/Scar o della cortactina, dei quali è nota la capacità di attivare il complesso Arp2/3, e successivamente l'abilità dell'IL-2 di modulare il loro stato di fosforilazione. 2B) Analisi del ruolo di Arf6 e dei suoi effettori molecolari nella regolazione dell'attività citotossica Ab-dipendente. L'attivazione del CD16 sulle cellule NK umane induce l'attivazione di Arf6 (Galandrini et al., osservazioni non pubblicate), una "small G protein" che regola il riarrangiamento del citoscheletro di actina e il traffico di vescicole, e controlla l'attivazione della PI4P-5K di tipo I e della fosfolipasi D (PLD). Analizzeremo il ruolo di Arf6 nella citotossicità NK Ab-dipendente, così come il contributo relativo di Rac1vs Arf6 nell'attivazione di PI4P-5K da parte del CD16. Il ruolo di Arf6 nella generazione dell'ADCC sarà valutato utilizzando virus vaccinici ricombinanti codificanti per Arf6 wild-type, o mutanti di Arf6 che mancano della capacità di legare (T27N) o di idrolizzare (Q67L) il GTP ottenuti dal Dr. Gary Thomas (Vollum Institute, Portland, OR). La citotossicità delle cellule NK che esprimono forme mutate di Arf6 sarà valutata mediante saggi di rilascio del 51Cr e di secrezione in seguito a stimolazione con CD16. Analizzeremo anche il ruolo relativo di Arf6 vs Rac1 nella polarizzazione dei granuli litici dopo stimolazione di cellule NK infettate con virus vaccinici ricombinanti che codificano per una forma dominante negativa di Rac1 (N17 Rac) forniti dal Dr. Paul Leibson (Mayo Clinic, Rochester, MN) o mutanti di Arf6, usando perforina fluorescente in esperimenti di microscopia confocale. Per comprendere il ruolo di Arf6 nell'attivazione della PI4-5PK indotta dal CD16, valuteremo la capacità del recettore di indurre la traslocazione dell'enzima in membrana e la sua associazione con Arf6. Le membrane e le frazioni citosoliche saranno preparate mediante ultracentrifugazione e verrà saggiata l'attività PI4P-5K delle varie frazioni. Il ruolo di Arf6 e Rac1 nel promuovere l'attivazione di PI4P-5K da parte del CD16 verrà determinato in cellule NK che overesprimono forme mutanti di queste proteine. Studieremo inoltre se Arf6 può regolare l'attivazione della PLD, enzima richiesto per l'esocitosi dei granuli indotta dal CD16 (Milella et al. 1999). L'attività enzimatica della PLD sarà valutata in cellule NK che overesprimono mutanti di Arf6 dopo stimolazione del CD16 in collaborazione con la Prof. MG Cifone dell'Università dell'Aquila. OBIETTIVO 3. Regolazione dell'espressione di recettori attivatori NK dipendente dal processo di endocitosi. Poche informazioni sono disponibili sugli eventi di segnalazione e sulle molecole effettrici coinvolte nel traffico endocitico dei complessi recettoriali del sistema immunitario (TCR, BCR, FcR, immuno-recettori). Nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che alcune subunità recettoriali contenenti sequenze ITAM quali la catena zeta del CD16 nelle cellule NK umane (Paolini et al 1999) vanno incontro ad ubiquitinazione dopo stimolazione del recettore suggerendo che questa modificazione post-traduzionale possa essere rilevante nello spegnimento dei segnali generati dagli immuno-recettori. Infatti, l'ubiquitinazione delle proteine di membrana può agire come segnale nel processo di endocitosi sia nell'internalizzazione del recettore a livello della membrana plasmatica sia nel compartimento endosomiale dove i recettori ubiquitinati sono destinati ai lisosomi per la loro degradazione. (Schnell e Hicke, 2003). Evidenze più recenti hanno identificato c-Cbl come la ubiquitino-ligasi (E3) responsabile dell'ubiquitinazione delle catene degli immuno-recettori. Nei recettori con attività tirosino chinasica intrinseca c-Cbl controlla anche l'internalizzazione reclutando al recettore, CIN85 e l'endofilina (componenti delle vescicole rivestite da clatrina) (Dikic, 2002). Attualmente non esistono dati sui meccanismi che controllano l'endocitosi dei recettori attivatori NK. Pertanto ci proponiamo di analizzare: il ruolo degli adattatori CIN85 e Cbl nel controllo dell'internalizzazione del CD16 e dell'NKG2D. Dati preliminari indicano che CIN85 è espresso nelle cellule NK umane e che la stimolazione del CD16 induce la fosforilazione in tirosina di Cbl (Cerboni et al 1998). Valuteremo quindi mediante co-immunoprecipitazione e western blot se la stimolazione del CD16 o dell'NKG2D induce la formazione di un complesso contenente Cbl, CIN85 e il recettore. La stimolazione del CD16 sarà effettuata utilizzando immunocomplessi solubili o cellule bersaglio opsonizzate con IgG. Per la stimolazione dell'NKG2D utilizzeremo ligandi ricombinanti solubili o cellule trasfettate con i suoi ligandi MICA e MICB. L'esistenza di un complesso Cbl/CIN85/endofilina nelle cellule NK stimolate e il ruolo nell'internalizzazione del recettore sarà inoltre valutato usando lentivirus che esprimono forme mutanti di CIN85. Le infezioni saranno effettuate con una generazione di lentivirus che non interferisce con l'espressione dei recettori di membrana sulle cellule NK (Zingoni, dati preliminari). L'internalizzazione del CD16 e dell'NKG2D indotta dai rispettivi ligandi sarà analizzata nelle cellule infettate mediante immunofluorescenza e microscopia confocale in collaborazione con la Prof. M Torrisi, Università di Roma "La Sapienza". Saranno condotti esperimenti anche pretrattando le cellule NK con inibitori dell'esocitosi e della degradazione lisosomiale al fine di analizzare il destino dei recettori attivati. OBIETTIVO 4. Regolazione delle risposte mediate dai linfociti T da parte delle cellule NK. 4A) Regolazione negativa mediante la lisi dei linfociti T. Definizione delle interazioni molecolari. Studi recenti suggeriscono che le cellule NK sono coinvolte nel controllo delle funzioni e dell'omeostasi dei linfociti T CD4+. Tuttavia, non e'noto quali siano i meccanismi mediante cui le cellule NK regolano negativamente le risposte T e inoltre non si conoscono le interazioni molecolari coinvolte. Ci proponiamo quindi di: a) analizzare l'espressione dei ligandi per alcuni recettori attivatori NK ed in particolare del ligando del CD244, il CD48, e dei ligandi dell'NKG2D (MICA, MICB, ULBP-1, -2 e –3 sui linfociti T CD4+ quiescenti o attivati con vari stimoli; b) studiare il ruolo di queste interazioni ligando-recettore nella lisi dei linfociti T mediata dalla cellule NK, mediante saggi di citotossicita' in cui verranno usati come bersagli sia linfociti T CD4+ attivati che quiescenti. Il contributo relativo dei recettori CD244 ed NKG2D sara' valutato mediante anticorpi bloccanti specifici. 4B) Regolazione positiva delle risposte mediate dai linfociti T. Diversi studi hanno evidenziato la capacitá delle cellule NK di regolare le risposte immunitarie adattative, grazie alle loro capacità di produrre citochine di tipo 1 o attivare le cellule dendritiche (Biron, 1997; Moretta, 2002). Esistono invece poche informazioni sull´interazione diretta tra cellule NK e cellule dell´immunità adattativa, ed in particolare dei linfociti T CD4+. Nel nostro laboratorio, abbiamo osservato di recente l´espressione di OX40L, una molecola della famiglia dei TNFR, in cellule NK pre-attivate con IL-2 o IL-15 e stimolate via CD16 o NKG2D. In esperimenti di co-coltura di cellule NK e cellule T CD4+ autologhe, abbiamo osservato che l´interazione OX40-0X40L fornisce un segnale co-stimolatorio importante per la proliferazione TCR-dipendente dei linfociti T, indotta da un anticorpo solubile anti-CD3 o dell´Enterotossina B dello Staphylococco (Zingoni et al., manoscritto sottomesso per la pubblicazione). Pertanto, ci proponiamo di analizzare quali sono le altre molecole coinvolte nell´interazione diretta tra cellule NK e cellule T. Buoni candidati sono il CD80 e CD86 e alcuni membri della famiglia dei TNFR (CD27L, CD30L,4-1BBL, GITRL). Mediante l´uso di anticorpi bloccanti specifici, cercheremo di identificare quali di queste molecole abbia un ruolo nella proliferazione e produzione di citochine da parte delle cellule T inseguito ad interazione con le cellule NK. Al fine di stabilire se le cellule NK inducano una polarizzazione della risposta T helper verso un fenotipo di tipo 1 o 2, e/o una proliferazione preferenziale delle cellule T regolatorie CD4+, e se l'interazione OX40L–OX40 abbia un ruolo in questi eventi, analizzeremo il pattern di citochine (IFN-gamma, IL-2 e IL-4, IL-10), prodotte nelle colture autologhe NK:T, mediante ELISA sul sovranatante di coltura o a livello intracellulare mediante citofluorimetria.
