RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Interazioni tra immunità innata ed immunità adattativa: dalla biologia alla clinica

Università di riferimento

Università degli Studi di BRESCIA - MATERNO-INFANTILE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE - BRESCIA(BS)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Luigi Daniele NOTARANGELO

Descrizione

Gli obiettivi principali del presente progetto di ricerca sono i seguenti: a) stabilire se l’ipotesi che il meccanismo di induzione della tolleranza centrale dipenda anche nell’uomo, come già dimostrato nel topo, dalla induzione del fattore trascrizionale AIRE a seguito della stimolazione mediata da linfotossina-alfa (LT-a), prodotta da timociti nascenti; b) analizzare l’espressione di recettori per chemochine in subsets di linfociti NK e in cellule dendritiche,verificando le conseguenze patologiche di una alterata espressione di recettori per chemochine (o di difetti di segnale attraverso questi recettori) sul traffico leucocitario e sulla distribuzione tissutale di queste cellule; c) proseguire gli studi di valutazione dell’interazione tra linfociti NK e cellule dendritiche. Tutti i suddetti obiettivi saranno perseguiti utilizzando come modelli alcune forme di immunodeficienza primitiva (IDP), ed in particolare: l’immunodeficienza combinata grave (SCID) e la sindrome di Omenn per qualche attiene all’obiettivo a); la sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS), la sua variante allelica piastrinopenia X-recessiva (XLT) e la sindrome WHIM per quel che riguarda gli obiettivi b) e c). La Clinica Pediatrica di Brescia rappresenta Centro di riferimento internazionale per la diagnosi e la terapia delle IDP. In particolare, nel corso degli anni, abbiamo realizzato una importante banca biologica ed istopatologica di tali malattie. Tale banca comprende materiali istologico congelato altrimenti non facilmente reperibile, come timo di pazienti SCID (n=3) e di pazienti con sindrome di Omenn (n=2), vari tessuti di pazienti con sindrome di Omenn (n=2), linfonodi da pazienti con sindrome di Wiskott-Aldrich (n=5), milza da pazienti con sindrome di Wiskott-Aldrich (n=2) o con piastrinopenia isolata X-recessiva (n=2). Inoltre, abbiamo isolato e conservato in azoto liquido campioni di cellule mononucleate da pazienti con sindrome di Omenn (n=12),con sindrome di Wiskott-Aldrich o con piastrinopenia X-recessiva (n=17), o con sindrome WHIM (n=5). Infine, sulla base dell’esperienza degli ultimi anni, è verosimile ipotizzare che ogni anno vengano riferiti alla Clinica Pediatrica di Brescia da altri Centri nazionali e stranieri circa 7 nuovi pazienti SCID (compresi casi di sindrome di Omenn) e circa 5-7 casi di WAS o XLT. Per tutte queste patologie, nonché per la sindrome WHIM, il Laboratorio di Genetica Molecolare della Clinica Pediatrica di Brescia offre diagnosi molecolare basata sull’analisi di sequenza del DNA, con analisi dei geni RAG-1 e RAG-2 (responsabili di SCID e di sindrome di Omenn), Artemis (causa di SCID), WASP (responsabile di WAS e di XLT) e CXCR4 (le cui mutazioni attivatorie in eterozigosi sono causa di WHIM). Ciò offre la garanzia di una diagnosi definitiva e costituisce al contempo la premessa per una più solida analisi dei risultati sperimentali. Al fine di raggiungere gli obiettivi sopra identificati, intendiamo procedere come segue: 1. Analisi del ruolo nell’uomo della via di segnale LT-a/AIRE al fine di promuovere meccanismi di tolleranza centrale a livello timico (durata: 1-12 mesi del progetto) Per raggiungere tale obiettivo, intendiamo utilizzare metodiche di analisi immunistochimica e molecolare su timo congelato. In particolare, attraverso una collaborazione con il gruppo del Dr. Harada (Kyushu University, Giappone) abbiamo ottenuto un anticorpo policlonale da coniglio diretto contro la proteina AIRE umana. In esperimenti preliminari abbiamo dimostrato che tale anticorpo reagisce in modo ottimale su sezioni di timo congelate, impiegando una tecnica di amplificazione secondaria con streptavidina-biotina-immunoperossidasi. La specificità di reazione dell’anticorpo anti-AIRE è stata da noi confermata in esperimenti preliminari con impiego di cellule COS7 (negative per l’espressione di AIRE), mentre un segnale chiaramente positivo è evidenziabile nelle cellule COS7 transfettate con il cDNA di AIRE. Sulla base di queste evidenze preliminari, intendiamo valutare in immunoistochimica la presenza e la distribuzione subcellulare (nucleare vs. citoplasmatica) di AIRE in sezioni di timo congelate e autoptiche derivate da pazienti SCID, da pazienti affetti da sindrome di Omenn, nonché nel timo di bambini non affetti da immunodeficienza (per questi ultimi il materiale,già disponibile, è stato ottenuto con consenso informato nel corso di interventi di cardiochirurgia). Parallelamente, sempre in immunoistochimica, verrà valutata l’espressione di CD3 (per evidenziare i linfociti T), citocheratina (per riconoscere le cellule epiteliali timiche), LT-a e del suo recettore. La coespressione dei diversi antigeni verrà analizzata in microscopia confocale, secondo una tecnica già ampiamente in uso in laboratorio. Dati nel modello murino indicano che AIRE è un potente induttore di proteine ectopiche tessuto-specifiche (insulina, citocromo-P450, GAD, ecc.) a livello dell’epitelio timico. In tal modo queste proteine, altrimenti destinate ad essere espresse solo in periferia, potrebbero essere presentate nel contesto di molecole HLA a timociti nascenti, inducendo la morte dei linfociti T autoreattivi. Intendiamo quindi analizzare se tale ipotesi sia applicabile anche nell’uomo. A tale scopo, mediante Real-time PCR, analizzeremo la quantità di mRNA specifico per cheratina-13 (marcatore di cellule epiteliali timiche), insulina e citocromo-P450 presenti nel timo dei soggetti di controllo e nei timi ottenuti da pazienti SCID e da soggetti con sindrome di Omenn. Come controllo interno di corretta qualità dell’RNA estratto dal timo verrà utilizzato la GAPDH. Infine, intendiamo caratterizzare il repertorio dei linfociti T a livello timico, nel sangue periferico e in diversi tessuti (cute, intestino, linfonodi) nei soggetti con sindrome di Omenn, al fine di evidenziare se esistono analogie di restrizione del repertorio tra quanto osservato in periferia e quanto dimostrato nel timo. In base alle premesse ed ai dati del modello murino, ci attendiamo che nel timo dei soggetti SCID e di quelli con sindrome di Omenn l’assenza o la severa riduzione di linfociti T dovrebbe associarsi ad un marcato difetto di LT-a, causando quindi un difetto di espressione di AIRE e di proteine ectopiche tessuto-specifiche. E’ verosimile anche che il repertorio linfocitario T risulti già ristretto a livello timico nei pazienti con sindrome di Omenn. In tal modo, sarà possibile confermare anche nell’uomo che la generazione di un repertorio T diversificato e ampio è essenziale per garantire in modo efficace il processo di selezione negativa che è alla base della tolleranza centrale, attraverso l’attivazione di AIRE e l’espressione di proteine tessuto-specifiche da parte delle cellule dell’epitelio timico. 2) Analisi del pattern di espressione di recettori per chemochine su linfociti NK e cellule dendritiche in pazienti WAS/XLT e in pazienti WHIM (durata 6-18 mesi del progetto) ed analisi dell’interazione tra linfociti NK e DC derivate da pazienti WAS/XLT e WHIM con valutazione del potenziale citotossico delle cellule NK contro diversi target cellulari (durata: mesi 12-24 del progetto). E’ ormai ampiamente stabilito che il traffico e l’homing leucocitario sono elementi essenziali per una corretta modulazione della risposta immunitaria. In particolare, le cellule dendritiche sono deputate a catturare l’antigene e a veicolarlo, attraverso processi di migrazione direzionale, nei tessuti linfoidi secondari, dove possono dare origine a fenomeni di “priming” dei linfociti T o al contrario di tolleranza immunologia. Questi processi sono guidati dall’espressione di recettori per chemochine che indirizzano la migrazione delle DC secondo il gradiente di concentrazione della chemochina stessa. Inoltre, il pannello di recettori per chemochine espressi dalle DC varia in funzione dello stato di maturazione delle DC stesse, in modo da adattarsi alle necessità biologiche. Peraltro, dati recenti indicano che l’interazione tra linfociti NK e DC sia cruciale per consentire l’attivazione delle cellule NK, che diverrebbero così in grado di lisare cellule infettate da virus o cellule neoplastiche. A questo proposito, è di grande interesse la recente dimostrazione che anche le cellule NK esprimono recettori per chemochine e che la distribuzione di tali recettori sia diversa nei due principali subsets di cellule NK. Le cellule CD56bright esprimerebbero marcatori di homing per i tessuti linfoidi secondari (CCR7, CD62L),ma anche CXCR4 e CCR5; al contrario, le cellule NK effettrici (CD56dim) esprimerebbero CXCR1 e CX3CR1, che legano rispettivamente IL-8 e fractalkina secrete da DC attivate nelle sedi di infiammazione in periferia. La migrazione delle DC e delle cellule NK è condizionata, oltre che dall’espressione di recettori per chemochine, anche dall’integrità dei processi di riorganizzazione del citoscheletro e di polimerizzazione dell’actina, ai quali contribuisce la proteina WASP. Sulla base di queste osservazioni, e della dimostrazione da parte del nostro gruppo che mutazioni del gene WASP si associano ad un’alterata differenziazione e migrazione delle DC e a difetti di riorganizzazione del citoscheletro e di citotossicità CD16-dipendente delle cellule NK, intendiamo procedere ulteriormente nella caratterizzazione delle alterazioni a carico di DC e linfociti NK in pazienti affetti da WAS/XLT. In particolare, ci ripromettiamo di: a) analizzare in dettaglio il repertorio di recettori per chemochine espressi dai linfociti NK circolanti di pazienti WAS e XLT. Tale studio verrà condotto in modo specifico sui due diversi principali subsets di linfociti NK (CD56dim e CD56bright) e verrà effettuato sia su linfociti freschi che dopo attivazione in vitro con diverse citochine (IL-2, IL-15, IL-21, IL-12). I risultati ottenuti in pazienti WAS/XLT verranno confrontati con quelli di soggetti sani di controllo paragonabili per età. Inoltre, considerando che nella WAS/XLT sembra esistere una correlazione genotipo-fenotipo, analizzeremo se eventuali alterazioni nella distribuzione delle sottopopolazioni NK o nel pattern di espressione dei recettori per chemochine siano distribuite in modo diverso nei pazienti WAS rispetto a quelli XLT; b) identificare nuovi recettori per chemochine espressi dalle cellule NK. A tale scopo, ci proponiamo di immunizzare topi balb/c con cellule NK restino per generare anticorpi monoclonali che riconoscono recettori per chemochine o nuove molecole recettoriali funzionalmente rilevanti. In questo senso, il nostro gruppo ha una comprovata esperienza, avendo già prodotto numerosi anticorpi monoclonali diretti contro recettori NK precedentemente non noti; c) studiare la distribuzione tissutale e l’espressione di recettori per chemochine da parte di DC e linfociti NK in pazienti WAS/XLT. A tal fine, faremo uso di sezioni di tessuto congelato (milza, linfonodi, cute) di pazienti WAS/XLT. La disponibilità di questo materiale consentirà di valutare la rilevanza in vivo delle alterazioni eventualmente dimostrate in vitro. Inoltre, sarà possibile verificare nell’uomo dati di recente pubblicazione relativi a topi knock-out per wasp, in base ai quali sarebbe sostanzialmente alterata la migrazione in vivo delle DC; d) analizzare l’interazione DC/NK in vitro in pazienti WAS/XLT, verificando le conseguenze di tale interazione sull’attivazione delle cellule NK. A tale scopo, cellule dendritiche immature (iDC) saranno generate a partire da monociti del sangue periferico, dopo coltura in vitro per 6 giorni in presenza di IL-4 e GM-CSF. Per generare DC mature, le iDC verranno stimolate con LPS per 24-48 ore. Anche sotto tale profilo, il nostro gruppo ha una consolidata esperienza nella generazione di DC in vitro, avendo già pubblicato dati sulla differenziazione delle DC in pazienti WAS/XLT. Una volta generate DC, queste verranno co-coltivate con linfociti NK. Sarà così possibile valutare l’attività litica dei linfociti NK nei confronti delle iDC e delle DC; in parallelo, l’attività citotossica delle cellule NK verrà valutata anche contro altri bersagli cellulari: P815 (in saggi di re-directed killing), linee linfoblastoidi (tra cui 721.221 e linee linfoblastoidi derivate dai pazienti stessi), linee tumorali di diversa origine istologica. In parallelo, verranno allestite colture con cellule di soggetti di controllo in modo da permettere di apprezzare eventuali anomalie in soggetti WAS/XLT; e) studiare le caratteristiche morfologiche e funzionali delle cellule NK di soggetti WHIM. Sulla base della dimostrazione che WHIM è legata a mutazioni attivatorie del recettore per chemochine CXCR4, che determinano un aumento di risposta chemiotattica dei neutrofili e dei linfociti T al ligando specifico (CXCL12), intendiamo verificare se anche le cellule NK dei pazienti WHIM siano funzionalmente ipersensibili al richiamo chemiotattico mediato da CXCL12. Verificheremo altresì se ciò si associa ad una diversa distribuzione delle due principali sottopopolazioni NK nel sangue periferico dei pazienti e/o ad alterazioni funzionali. Tali alterazioni potrebbero rivestire un ruolo importante ai fini dell’aumentata suscettibilità dei pazienti WHIM ad infezioni croniche e severe da papillomavirus (HPV) . Poiché dei cinque pazienti WHIM da noi identificati (e confermati a livello molecolare), solo 3 presentano infezione da HPV, sarà possibile stabilire se eventuali alterazioni a carico dei linfociti NK in soggetti WHIM sono primitive o secondarie all’infezione virale. Nel complesso, quindi, questo progetto si ripromette di analizzare il ruolo che alterazioni all’interfaccia tra immunità innata ed immunità adattiva possono rivestire nella fisiopatologia di alcune forme di immunodeficienza primitiva. Oltre a consentire approcci preventivi e terapeutici più mirati in queste malattie, i risultati di questo studio potranno offrire una migliore comprensione delle basi cellulari e molecolari di differenziazione e maturazione delle risposte immunitarie, confermando l’utilità di studiare le immunodeficienze primitive come modello.