RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Interazioni tra immunità innata ed immunità adattativa: dalla biologia alla clinica

Università di riferimento

Universita' degli Studi di ROMA - BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO - ROMA(RM)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Enza PICCOLELLA

Descrizione

Piano Sperimentale L'unità di ricerca di Piccolella ha recentemente dimostrato che l'interazione del CD28 con B7 induce nei linfociti T CD4+ isolati dal sangue periferico e non in quelli isolati dal sangue di cordone ombelicale (CD) (Marinari et al., 2004) l'espressione dei geni che codificano per Bcl-xL e per le chemochine IL-8 e BAFF. Questi risultati suggeriscono che il CD28 segnali in maniera diversa nelle cellule naive rispetto a quelle della memoria. Partendo da queste osservazioni, lo scopo di questo progetto sarà quello di chiarire i meccanismi attraverso i quali ciò può avvenire. Pertanto noi analizzeremo nelle cellule T CD4+ naive e della memoria, entrambe isolate dal sangue periferico e stimolate con CD28,: 1) l'espressione dei geni con attività anti-apoptotica e quelli delle chemochine; 2) i segnali immediati e quelli tardivi che a partire dal CD28 portano alla traslocazione nucleare di NF-kB; 3) il reclutamento delle subunità di NF-kB sui promotori dei geni bersaglio di CD28; 4) l'acetilazione dei promotori dei geni dell'IL-8 e Bcl-xL;5) la rilevanza funzionale della serezione di IL-8 mediata dal CD28 sulla migrazione cellulare. 1) Analisi nelle cellule T CD4+ sia naive che della memoria, isolate dal sangue periferico e stimolate con CD28, dell'espressione dei geni con attività anti-apoptotica e quelli delle chemochine I nostri dati riferenti all'incapacità dei linfociti T CD4+ del cordone ombelicale, (>90% cellule naive) rispetto a quelli del sangue periferico (60-70% cellule della memoria), entrambi stimolati dal CD28 (Marinari et al., 2004), di indurre l'attivazione dei geni che codificano per le proteine anti-apoptotiche e per le chemochine suggeriscono che l'IL-8 e i segnali di sopravvivenza stimolati dal CD28 possono servire ai linfociti T della memoria per accumularsi nei tessuti dove è presente l'antigene ed attrarre le cellule dell'immunità innata ed adattativa. Per confermare questa ipotesi, noi analizzeremo gli effetti della stimolazione del CD28 sull'espressione di Bcl-xL e di IL-8 e BAFF nelle cellule T CD4+ sia naive che memoria. A questo scopo, linfociti T CD4+ umani arricchiti dopo isolamento dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) mediante il sistema MACS (Miltenyi Biotec, Milano, Italy) saranno coltivati in RPMI 1640 con il 5% di siero umano (Euroclone, UK), L-glutammina, penicillina e streptomicina (Gibco-BRL, Grand Island, NY). I linfociti T CD4+ saranno quindi frazionati in naive e della memoria mediante biglie magnetiche ricoperte dagli anticorpi anti-CD45RA o anti-CD45RO (Miltenyi Biotec). Una volta purificate tali cellule saranno stimolate per tempi diversi con fibroblasti murini aderenti esprimenti le molecole B7.1 umane (Dap/B7). L'espressione degli mRNA codificanti per Bcl-xL, IL-8 e BAFF sarà analizzata in RT-PCR. La secrezione dell'IL-8 verrà misurata mediante ELISA, mentre la traduzione di Bcl-xL valutata in western blotting. In questo modo saremo in grado di stabilire se il CD28 può inviare segnali in grado di favorire l'induzione dei geni regolati da NF-kB e l'espressione delle relative proteine solo nelle cellule della memoria. 2) Analisi, in cellule T CD4+ naive e della memoria stimolate mediante CD28, dell'attivazione di IKKs e della traslocazione nucleare di RelA e di p52 Abbiamo dimostrato che CD28, nelle cellule T, attiva NF-kB cooperando con Vav-1 e IKKalpha (Piccolella et al., 2003) e mette in moto la traslocazione nucleare di eterodimeri RelA/p52 preesistenti (Marinari et al., 2004). Così, per comprendere a quale livello il signaling di CD28 verso NF-kB possa essere modificato in cellule T della memoria Vs naive e per dare conto delle differenti risposte osservate a livello trascrizionale, esamineremo sia l'attività chinasica del complesso IKK sia la traslocazione nucleare delle sub-unità di NF-kB. I linfociti T CD4+ della memoria e naïve saranno stimolati per 15 min. con cellule Dap3/B7 aderenti. IKKalfa; sarà immunoprecipitato e l'attività chinasica del complesso IKK sarà misurato in un saggio chinasico in vitro usando GST-IkBalpha come substrato. In parallelo analizzeremo la degradazione di IkBalfa in western blotting. Per esaminare la translocazione nucleare delle sub-unità di NF-kB, cellule T naive e con memoria saranno stimolate per diversi intervalli di tempo (da 15 minuti a 24 ore) con cellule aderenti Dap/B7. Estratti citoplasmici e nucleari saranno preparati come precedentemente descritto (Tuosto et al., 2000). Le proteine citoplasmiche e quelle nucleari verranno separate su SDS-PAGE, trasferite su membrane di nitrocellulosa e la presenza delle sub-unità RelA, p50, p52 e RelB di NF-kB saranno analizzate mediante Western Blotting usando specifici anticorpi (Santa Cruz Biotechnology). In parallelo l'estratto nucleare sarà analizzato tramite un "electromobility shift assay" per verificare l'attività di binding di NF-kB. In particolare, estratti nucleari saranno incubati con "32P-radiolabeled NF-kB oligonucleotide probe" (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') per venti minuti a temperatura ambiente e i complessi DNA-proteina evidenziati mediante gel nativi di polyacrilamide al 5%. In tal modo sarà possible verificare se: i) la stimolazione di CD28 attivi il complesso IKK e NF-kB in misura simile o differente in cellule T naïve rispetto a quelle della memoria; ii) CD28 induca l'attivazione e la translocazione nucleare di un differente sottoinsieme di sub-unità NF-kB in cellule T naive rispetto a quelle della memoria. 3) Analisi del reclutamento di RelA e p52 sui promotori di IL-8 e Bcl-xL in cellule T naive e della memoria a seguito di stimolazione del CD28 CD28 induce la translocazione nucleare sia di eterodimeri RelA/p52 che di omodimeri RelA con attività funzionale transcrizionale sui promotori di IL-8 and Bcl-xL in cellule primarie T CD4+ (Marinari et al., 2004). In questo progetto analizzeremo il reclutamento di sub-unità RelA e NF-kB su i geni di IL-8 e Bcl-xL in cellule T sia naive che della memoria. A tal fine effettueremo esperimenti di "cromatin immunoprecipitation" (ChIP), come precedentemente descritto (Saccani et al., 2001). Cellule T naive e della memoria saranno stimolate per differenti tempi con cellule aderenti Dap3/B7. Dopo la stimolazione le cellule saranno fissate in formaldeide, che promuove la formazione di legami trasversali stabili proteine-DNA e, quindi, preserva le interazioni proteine-DNA. Le cellule saranno quindi lisate per 5 minuti in 50 mM Tris, pH 8.0, 2 mM EDTA, 0.1% NP-40, 10% glicerolo in presenza di inibitori delle proteasi. I nuclei saranno risospesi in 50 mM Tris, pH 8.0, 1% SDS, e 5 mM EDTA. La cromatina sarà quindi sonicata, centrifugata e diluita 10 volte in 50 mM Tris, pH 8.0, 0.5% NP-40, 0.2 M NaCl, 0.5 mM EDTA. Dopo una iniziale purificazione con una sospensione al 50% di proteina A saturata con sperma di salmone, i lisati saranno incubati a 4°C per una notte con anticorpi purificati per affinità diretti contro p52 o RelA, o con anticorpi anti-RNA polymerase II (pol II) per controllare l'attivazione transcrizionale. I complessi immuni saranno raccolti utilizzando proteine A saturata con sperma di salmone, lavati tre volte con un tampone ad alta concentrazione di sali (20 mM Tris, pH 8.0, 0.1% SDS, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl), e cinque volte con 1x Tris/EDTA (TE). I complessi immuni saranno estratti in lx TE contenenti l'1% di SDS e i legami trasversali proteine-DNA saranno rimossi per riscaldamento a 65°C per una notte. Il DNA sarà estratto mediante fenolo-cloroformio e circa 1/20 del DNA immunoprecipitato sarà amplificato mediante PCR con primers specifici per i promotori dei geni dell'IL-8 e Bcl-xL . 4) Analisi dello stato di acetilazione degli istoni dei geni dell' IL-8 e Bcl-xL in cellule naïve e della memoria. Le modificazioni nella struttura della cromatina sottendono l'acquisizione di competenze ereditabili nella trascrizione di alcuni geni. L'acetilazione dell'istone delle code N-terminali del core a livello dei residui lisinici regola la trascrizione: i) facendo venire meno la capacità degli arrays nucleosomiali di formare strutture di folding di livelli superiore e rinforzando in tal modo l'accessibilità del sottostante genoma alle proteine di binding al DNA (Tse et al., 1998); ii) contrastando l'effetto inibitore esercitato dalle code istoniche sul fattore trascrizionale accessibile al DNA nucleosomale (Lee et al., 1993). Per di più l'acetilazione favorisce il reclutamento alla cromatina e/o l'attivazione di proteine implicate nella regolazione trascrizionale, quali i coattivatori e gli enzimi rimodellanti la cromatina. Pertanto l'acetilazione verosimilmente contribuisce ad una elevata e veloce trascrizione del corrispondente gene a seguito di stimolazione, come recentemente osservato per i geni delle citochine Th1 e Th2 nelle cellule con memoria (Messi et al., 2003). L'incapacità della stimolazione di CD28 di indurre la trascrizione dei geni per IL-8 e per Bcl-xL in cellule T naive può essere posta in relazione ai pattern di acetilazione del gene. Per verficare ciò, cellule T naive e della memoria saranno stimolate per tempi diversi con cellule aderenti Dap/B7 e lo stato di acetilazione dell'istone H3 a livello dei promotori dei geni per l'IL-8 e Bcl-xL sarà fatto oggetto di indagine utilizzando la metodica dei ChIP e trattando i lisati con IgG policlonali di coniglio diretti contro l'acetyl-histone H3 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). 5) Rilevanza funzionale della serezione di IL-8 mediata dal CD28 sulla migrazione cellulare. Uno tra i processi più importanti della risposta infiammatoria è il reclutamento tissutale dei leucociti. La chemiotassi coinvoge una complessa cascata di eventi molecolari che comprendono la formazione di complessi di segnalazione, la polarizzazione dei recettori, l'attivazione delle molecole di adesione e la riorganizzazione del citoscheletro. Durante la migrazione e l'attivazione i linfociti subiscono molti cambiamenti morfologici (Springer, 1994). In particolare, i linfociti T attivati polarizzano e sviluppano una ben definita protuberanza citoplasmatica, chiamata uropodo (Campanero et al., 1994). L' IL-8 è in grado sia di modulare l'espressione di particolari recettori per chemochine e così contribuire al reclutamento cellulare nei siti del riconoscimento antigenico (Sallusto et al., 1999) sia di indurre la formazione dell'uropodo (del Pozo et al., 1995). Per verificare se attraverso la produzione di IL-8, il CD28 possa influenzare la migrazione leucocitaria, saranno esaminate sia la polarizzazione del recettore per IL-8 sia la polarizzazione dei leucociti stessi. I linfociti T CD4+ saranno stimolati con i Dap/B7 aderenti per 96 ore (il tempo in cui si osserva la massima produzione di IL-8) (Marinari et al., 2004) ed i sopranantanti di coltura saranno prelevati. In parallelo saranno preparate colture di linfoblasti T a partire dai PBMC mediante trattamento con fitoemoagglutinina (PHA) 0.5% per 48 ore. Le cellule saranno successivamente lavate e coltivate per altri 7-12 giorni con RPMI 1640 contenente il 10% FCS e 50 U/ml IL-2 (Euroclone). Vetrini coprioggetto saranno ricoperti con 50 microl di 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, contenente ICAM-1-Fc ricombinante, per 2 ore a 37°C e saturati con PBS contenente 1% di sieroalbumina umana (HSA) per 30 minuti a 37°C. 2x106 cellule linfoblastoidi T saranno incubate in piastre a fondo piatto da 24 pozzetti (Costar Corp., MA) in un volume finale di 500 microl sui vetrini ricoperti con ICAM-1. Dopo aver aggiunto diverse diluizioni dei sovranantanti di coltura di linfociti T CD4+ stimolati con CD28, si lasceranno sedimentare i linfoblasti a 37°C per differenti periodi di tempo (dai 15 minuti alle 18 ore). Le cellule saranno successivamente fissate in 4% di formaldeide e dopo estensivi lavaggi, sarà analizzata la distribuzione di varie molecole di adesione mebranarie mediante l'utilizzo di anticorpi specifici. In particolare, sarà analizzata la ridistribuzione e polarizzazione membranaria del recettore per IL-8, di LFA-1 e di ICAM-3. Le cellule saranno osservate utilizzando un microscopio confocale Leica con obiettivi ad immersione ad olio da 40, 60 e 100 X. La percentuale delle cellule aventi l'uropodo sarà calcolata su scelte casuali di differenti campi di osservazione (con obiettivo da 60 X) per ciascuna condizione, contando direttamente il numero totale di cellule (400-500) e di cellule dotate di uropodo. 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Messi, M., Giachetto, I., Nagata, K., Lanzavecchia, A., Natoli, G. and Sallusto, F. (2003) Memory and flexibility of cytokine gene expression as separable properties of human T(H)1 and T(H)2 lymphocytes. Nat. Immunol., 4, 78-86. Piccolella, E., Spadaro, F., Ramoni, C., Marinari, B., Costanzo, A., Levrero, M., Thompson, L., Abraham, R.T. and Tuosto, L. (2003) Vav-1 and the IKKa subunit of IkB kinase (IKK) functionally associate to induce nuclear factor-kB activation in response to CD28 engagement. J. Immunol., 170, 2895-2903. Saccani, S., Pantano, S. and Natoli, G. (2001) Two waves of nuclear factor kB recruitment to target promoters. J. Exp. Med., 193, 1351-1359. Sallusto, F., Kremmer, E., Palermo, B., Hoy, A., Ponath, P., Qin, S., Forster, R., Lipp, M. and Lanzavecchia, A. (1999) Switch in chemokine receptor expression upon TCR stimulation reveals novel homing potential for recently activated T cells. Eur. J. Immunol., 29, 2037-2045. Springer, T.A. (1994) traffic signals for lymphocyte recirculation and leuocyte migration: the multistep paradigm. Cell, 76, 301-314. Tse, C., Sera, T., Wolffe, A.P. and Ansen, J.C. (1998) Disruption of high-order folding by core histone acetylation drammatically enhances trascription of nucleosomal arrays by RNA plymerase III. Mol. Cell. Biol., 18, 4629-4638. Tuosto, L., Costanzo, A., Guido, F., Marinari, B., Vossio, S., Moretti, S., Levrero, M. and Piccolella, E. (2000) Mitogen-activated kinase kinase kinase 1 regulates T cell receptor- and CD28-mediated signaling events which lead to NF-kB activation. Eur. J. Immunol., 30, 2445-2454.