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Allo scopo di identificare i requisiti per una cross-presentazione ottimale, abbiamo già allestito un sistema in vitro in cui DC umane sono capaci di cross-presentare un antigene esogeno - la proteina ricombinante NS3(1187-1465) del virus dell'epatite C (HCV) - ad un clone T CD8 HLA-A2 compatibile specifico per l'epitopo NS3(1406-1415). In particolare le DC venivano pulsate con diverse concentrazioni di NS3 o il peptide rilevante, fissate, e quindi poste in co-cultura con il clone CD8 per 6 h a 37°C. Alla seconda ora, venivano aggiunti 10 mcg/ml di Brefeldina-A e le cellule T colorate con anti-CD8, processate per lo staining a livello intracitoplasmatico con anticorpi anti-IFN-gamma, allo scopo di detrminare la quantità di cellule secernenti tale citochina. Le DC immature (iDC), prese a diversi tempi di coltura, mostravano simili efficienze di cross-presentazione, di stimolazione (valutata attraverso la loro capacità di presentare il peptide), di fagocitosi, così come simile fenotipo di membrana. Questi dati suggeriscono che la coltura in presenza di GM/CSF ed IL-4 mantegono congelate le iDC nello stesso stadio di differenzazione per molto tempo. Al contrario, sia le DC mature (mDC) sia le APC nonprofessionali, come le cellule B trasformate dal virus di Epstein-Barr (EBV-B), erano incapaci di cross-presentare, confermendo che la cross-presentazione è un requisito delle iDC o dei macrofagi ed è differentemente regolata durante la maturazione delle DC. In questo studio, nel corso del I anno, valuteremo i seguenti punti. 1.Se le iDC siano più o meno efficienti nel presentare l'antigene alle cellule T CD4 o CD8, allo scopo di verificare se il macchinario endocitico di processing sia indirizzato a presentare gli antigeni esogeni con la stessa o differente efficienza sulle molecole di classe I o II. 2. Se il compartimento endocitico, notoriamente essenziale per la presentazione dei peptidi sulle molecole di classe II, sia altrettanto indispensabile per frammentare gli antigeni che verranno in seguito cross-presentati attraverso la via citosolica. A questo scopo, verificheremo se l'inibizione del processing endocitico, che blocca la presentazione di classe II, faccia altrettanto sulla presentazione di classe I. Dal momento che recenti dati dimostrano che la cross-presentazione è dipendente dalla presenza nei fagosomi dei translocons e di TAP (acquisiti attraverso la fusione con la membrana dell'ER), i quali sarebbero poi persi dagli endosomi tardivi, è ipotizzabile che soltanto i fagosomi e possibilmente gli endosomi precoci, e non quelli tardivi, abbiano la capacità di cross-presentare. Quindi, verificheremo se la cross-presentazione viene incrementata bloccando la maturazione dei fago/endosomi in endo/lisosomi con specifici inibitori, che stiamo testando nel nostro laboratorio. 3. In collaborazione con la prof. Maria Rosaria Torrisi (Dip. Medicina Sperimentale, Università La Sapienza - Roma), valuteremo il traffico dell'NS3 in seguito a pulsing/chase di iDC, mDC, e EBV-B, mediante microscopio confocale, usando opportuni mAbs anti-NS3, anti-recettore della transferrina (marker di endosomi precoci), anti-catapsina D (marker di endosomi tardivi), anti-TAP (per verificare se esso è espresso sulla membrana degli endosomi precoci, oltre che su quelle dei fagosomi e dell'ER). Quello che ci attendiamo è che l'NS3 possa essere maggiormente accumulato negli endosomi precoci, e quindi maggiormente trasportato nel citosol, in seguito ad inibizione della maturazione dei fago/endosomi in endo/lisosomi. Durante il II anno del progetto definiremo i seguenti punti: 1. Verificheremo se l'inibizione del processing endocitico nelle DC potrebbe indurre risposte di cellule T CD8 specifiche per diversi antigeni virali (HCV o HIV) o tumorali direttamente dalle PBMC. A questo scopo, PBMC fresche isolate da soggetti con diverse infezioni verranno direttamente posti in coltura con gli antigeni rilevanti (NS3 in primis, poi estenderemo ad altri antigeni virali o tumorali) in presenza o assenza di differenti inibitori del processing endocitico o che inibiscono la maturazione dei fago/endosomi in endo/lisosomi, e valuteremo se tale strategia incrementa la generazione di risposte di linfociti T CD8 specifiche ex vivo. Questo approccio avrebbe una grande implicazione in patologia. Infatti potrebbe essere utile per generare grandi quantità di linfociti T CD8, indispensabili per studi in vitro o per allestire strategie di immunoterapia. Inoltre, il successo di vaccini innovativi potrebbe avere un decisivo supporto dall'uso di composti che incrementano la cross-presentazione, allo scopo di indurre una immunità CD8 antivirale o antitumorale in vivo. Generalmente, sia i vaccini convenzionali sia gli adiuvanti usati nell'uomo sono incapaci di indurre risposte CD8. L'impiego di potenziali incrementatori della cross-presentazione potrebbe essere cruciale per disegnare strategie innovative atte a indurre risposte primarie CD8 protettive. 2. Metteremo a punto un sistema murino in vivo di immunizzazione con DC pulsate con gli antigeni rilevanti e manipolate allo scopo di incrementare la cross-presentazione. Questo permetterà di verificare se tale strategia possa essere usata per indurre facilmente risposte primarie di linfociti T CD8 protettivi in vivo.
