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Il programma della nostra U.O. è focalizzato su due obiettivi principali: 1) l'analisi dello sviluppo in vivo delle cellule NK, utilizzando come modello il trapianto di cellule staminali emopoietiche 2) lo studio di nuove molecole di membrana espresse da cellule tumorali ed in grado di inibire la funzione NK. 1) Sviluppo delle cellule NK in vivo: il modello del trapianto di cellule staminali emopoietiche. In studi precedenti, grazie alla disponibilità di tutta una serie di mAbs specifici per recettori attivatori ed inibitori, è stato possibile definire vari stadi maturativi caratterizzati dall'espressione sequenziale di tali recettori. Una caratteristica di rilievo è costituita dal fatto che la presenza di un macchinario citolitico efficiente e di recettori attivatori precede quella dei recettori inibitori HLA-Cl I - specifici. Questa situazione sembrerebbe di difficile spiegazione, data la coesistenza nel midollo sia di cellule NK che di potenziali bersagli suscettibili (precursori emopoietici). La probabile soluzione del problema è stata da noi identificata in vitro grazie alla scoperta che il corecettore 2B4, espresso molto precocemente dalle cellule emopoietiche e dalle NK in via di maturazione, ha, in queste cellule, funzione inibitoria. Questo è dovuto all'espressione tardiva del polipeptide citoplasmatico SAP il quale, legandosi alla porzione citoplasmatica del 2B4, previene il reclutamento e l'attivazione di SHP-1 (responsabile della funzione inibitoria). Pertanto, proprio l'assenza di SAP conferisce al 2B4 una funzione inibitoria, innescata dall'interazione col suo ligando principale, il CD48, espresso in notevoli quantità sulle cellule emopoietiche midollari. Avendo come base di partenza gli studi in vitro suddetti, intendiamo analizzare l'evoluzione fenotipica e funzionale delle cellule NK derivate da precursori emopoietici nel corso di trapianto midollare. Le cellule NK si sviluppano piuttosto rapidamente dai precursori emopoietici e, per un certo periodo dopo l'attecchimento del trapianto, costituiscono la popolazione linfo-monocitaria largamente prevalente nel sangue periferico. Sebbene, in vari pazienti, le cellule NK riscontrabili in circolo abbiano un fenotipo maturo, in alcuni pazienti si riscontrano invece cellule NK con un fenotipo nettamente immaturo. Queste cellule saranno oggetto del nostro studio sia per quanto riguarda la loro ulteriore maturazione in vivo (o in vitro), sia,soprattutto per quanto riguarda gli aspetti funzionali. È infatti evidente che una immaturità funzionale accompagnata da una funzione inibitoria del 2B4, potrebbe essere alla base di una incapacità di controllare infezioni virali (una delle principali cause di mortalità post-trapianto). In maggiore dettaglio, oltre all'espressione di CD56 e CD16, verrà analizzata l'espressione dei vari recettori attivatori ed inibitori. Dal punto di vista funzionale, oltre ad essere valutata la capacità di lisare cellule bersaglio classiche verrà analizzata la funzione di singoli recettori o corecettori attivatori con particolare attenzione alle molecole 2B4 ed NTBA (entrambi dipendenti da SAP e capaci di funzione inibitoria in assenza di SAP stessa). Riteniamo che l'analisi funzionale di popolazioni NK che si sviluppano da precursori mieloidi in seguito a trapianto di cellule staminali, possa fornire non solo informazioni sugli stadi maturativi delle cellule NK ma fornire anche informazioni di carattere prognostico sulla probabilità di sviluppare infezioni/riattivazioni virali, particolarmente critiche nel decorso post-trapianto. 2) studio di una nuova molecola di membrana, espressa da cellule tumorali, in grado di inibire la funzione NK. Molecole codificate da virus, in grado di svolgere un ruolo protettivo nei confronti dell'attività citolitica delle cellule NK sono state identificate recentemente. Nel tentativo di isolare nuovi antigeni di membrana, possibilmente tumori-specifici, abbiamo identificato, molto recentemente, grazie al mAb 5B14, un antigene di membrana, espresso da cellule di neuroblastoma. Al contrario del marcatore più utilizzato per la diagnosi di neuroblastoma vale a dire l'espressione del ganglioside GD2, la molecola 5B14 è espressa da tutte le linee di neuroblastoma così come da tumori freschi. Inoltre, a livello del midollo osseo (sede molto frequente di ricadute del tumore stesso), la molecola 5B14 è espressa selettivamente da cellule tumorali (il che non avviene per il GD2 che in seguito a "shedding" può legarsi anche ad altri tipi cellulari e dare un notevole background di colorazione). È attualmente in corso la caratterizzazione molecolare di 5B14, che permetterà di comprendere se si tratti di molecola già nota o di un nuovo membro di famiglie molecolari specializzate in particolar funzioni. Un dato di notevole interesse è emerso nel corso di studi focalizzati sulla comprensione di un possibile ruolo funzionale della molecola stessa. Infatti abbiamo potuto osservare come 5B14 svolga un ruolo protettivo nei confronti della lisi NK-mediata. In presenza di anticorpo anti-5B14 (in grado quindi di "mascherare" la molecola), si ha un ripristino della lisi (non spiegabile sulla base di fenomeni del tipo ADCC o di artefatti). Questo suggerisce chiaramente un ruolo protettivo esercitato da 5B14 dalla lisi NK-mediata. Come corollario, è necessario ipotizzare l'esistenza di un recettore putativo a funzione inibitoria, espresso dalle cellule NK ed in grado di bloccarne la citotossicità. Pertanto il nostro progetto oltre all'identificazione ed al clonaggio molecolare di 5B14, prevede l'identificazione e la caratterizzazione molecolare del recettore NK inibitorio specifico per 5B14. Verrà dapprima analizzata l'ampia serie di recettori a funzione inibitoria da noi identificati (a tutt'oggi orfani, vale a dire dei quali non si conosce il ligando). Successivamente, se questo primo screening non darà risultato, verranno prodotti e selezionati nuovi mAbs in grado di riconoscere il putativo recettore inibitorio.
