RICERCA ITALIANA     

Programma di ricerca

Interazioni tra immunità innata ed immunità adattativa: dalla biologia alla clinica

Università di riferimento

Università degli Studi di PERUGIA - MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE - PERUGIA(PG)

Responsabile dell'Unità di ricerca

Andrea VELARDI

Descrizione

Obbiettivo 1. Alloreattività mediata da cellule NK nel trapianto aploidentico: selezione del donatore e esito del trapianto. Identificazione accurata dei donatori che sono in grado di produrre risposte allogeniche verso il ricevente mediate da cellule NK allo scopo di incrementare la possibilità di trovare un donatore NK alloreattivo Overview e dati preliminari Una conseguenza importante dei nostri precedenti studi sul ruolo dell'alloreattività NK nel trapianto aploidentico è la necessità di rivedere i criteri attuali per la selezione del donatore (e dunque includere, come criterio principale, l'alloreattività NK del donatore verso il ricevente). In aggiunta, dati recenti che emergono da studi retrospettivi suggeriscono che le disparità del locus HLA di classe I che determinano l'alloreattività NK del donatore verso il ricevente sono vantaggiose anche nel trapianto da donatore non familiare (6). Fino a questo momento la selezione dei donatori NK alloreattivi (che possono essere trovati fin nel 60% delle coppie donatore-ricevente) è stata basata sulla tipizzazione del locus HLA tramite tecniche sierologiche e molecolari ad alta risoluzione perché abbiamo riscontrato una correlazione del 100% tra specifiche disparità HLA e l'identificazione del repertorio alloreattivo NK nei donatori. I geni che codificano per i recettori inibitori delle cellule NK che legano alleli HLA-C di gruppo 1 (KIR2DL2/3) sono presenti nel 100% degli individui che abbiamo analizzato (n=162). Il gene del recettore inibitorio per gli alleli HLA-C di gruppo 2 nel 97% degli individui. Il gene del recettore inibitorio per HLA-Bw4 (KIR3DL1) è stato trovato nel 94% degli individui. Alcuni individui posseggono varianti alleliche del gene KIR3DL1 che non permettono l'espressione piena del recettore sulla membrana cellulare e altri, pur possedendo il gene, possono esprimere i corrispondenti cloni NK a basse frequenze. L'analisi funzionale diretta del repertorio alloreativo NK del donatore, un procedimento che richiede molto tempo e lavoro, è attualmente l'unico modo di identificare questi donatori. Disegno sperimentale Sebbene la tipizzazione HLA sia sufficiente per predire l'alloreattività NK per quasi tutte le disparità di gruppo HLA-C, per raggiungere il 100% di accuratezza la tipizzazione HLA-C ad alta risoluzione molecolare dovrà essere affiancata dall'analisi del genotipo KIR. Per l'accurata identificazione dei donatori con disparità HLA-Bw4, oltre all'analisi del genotipo KIR a livello di locus (KIR3DL1), sarà introdotta quella a livello allelico. L'analisi funzionale diretta del repertorio alloreattivo NK sarà utilizzata come controllo standard ottimale. Stimiamo che approssimativamente 60-70 donatori saranno testati durante i 2 anni del progetto. Dopo un follow-up minimo di 6 mesi dalla data del trapianto, pazienti trapiantati per leucemia acuta mieloblastica (LAM) verranno valutati in termini di incidenza di rigetto, GVHD, mortalità infettiva e mortalità trapianto-relata, recidiva, e sopravvivenza. Verranno paragonati gli outcomes clinici dei pazienti trapiantati da donatore aploidentico con potenzialità di esercitare alloreattività NK nei confronti del ricevente verso gli outcomes dei pazienti trapiantati da donatori che non hanno potenzialità di esercitare reazioni allo geniche NK nei confronti del ricevente. Pazienti e Metodi I pazienti sono sottoposti a regime di condizionamento con TBI, thiotepa, ATG e fludarabine. La deplezione delle cellule T da cellule di sangue periferico del donatore mobilizzate con il fattore che stimola le colonie di granulociti (G-CSF) è realizzata tramite selezione di cellule CD34+ con Clinimacs. L'analisi del genotipo KIR e dell'allele KIR3DL1 sono realizzate come descritto nelle ref. 7 e 8. I cloni NK sono prodotti e testati per alloreattività. Obbiettivo 2. Trasferimento d'immunità ai patogeni dal donatore al ricevente attraverso le barriere HLA. 1) Mettere a punto in vitro le condizioni per trasferire in maniera sicura dopo il trapianto l'immunità mediata da cellule T verso CMV e Aspergillus fumigatus attraverso la barriera dell' HLA. 2) Determinare se questo trasferimento è clinicamente efficace nella prevenzione e nel controllo dell'infezione, tramite il monitoraggio dell'antigenemia di Aspergillus Galactomannan e CMV, in associazione ai parametri clinici. Overview e dati preliminari Una delle più importanti e attuali questioni rimane l'alta incidenza della mortalità dovuta ad infezione (30-40%). Uno dei principali agenti infettivi responsabili è il CMV e infatti molti studi hanno confermato che la positività per CMV è un fattore di rischio di mortalità persino in riceventi di trapianto da donatore compatibile identico o non familiare. La riattivazione del CMV prosegue per parecchi mesi dopo il trapianto fino a quando non si sviluppano risposte cellulari T specifiche. Durante questo periodo i pazienti sono a rischio di polmoniti, encefaliti e enteriti fatali causate da CMV. Dal momento che il CMV altera la funzione delle cellule detritiche, esso è di per se stesso immunosoppressivo, e in aggiunta gli agenti anti-CMV causano leucopenia e immunosoppressione delle cellule T. I riceventi di trapianto sono anche a rischio di aspergillosi invasiva, l'altra causa molto comune di mortalità dovuta ad infezione, e gli agenti anti-fungini sono largamente inefficaci. La suscettibilità all'aspergillosi continua persino dopo che la normale conta dei neutrofili è stata recuperata e, come atteso, lo sviluppo di cellule T di memoria specifiche è necessario per la difesa dell'ospite contro l'Aspergillus. Noi riteniamo che la protezione contro la GVHD mediata dalle cellule NK potrà essere sfruttata per consentire il trasferimento di cellule T del donatore al fine di ricostituire l'immunità all'infezione (vedi il successivo task). Una strategia alternativa e non mutualmente esclusiva che potrebbe essere utilizzata sinergisticamente è descritta in seguito. Intendiamo sperimentare come trasferire in maniera sicura e efficace l'immunità del donatore ai patogeni attraverso le barriere HLA. Dal momento che le risposte immuni contro gli agenti infettivi e gli antigeni dominanti mostrano reattività crociata ad alloantigeni, particolarmente attraverso le barriere dell'istocompatibilità, noi ipotizziamo che i cloni di cellule T che reagiscono in maniera crociata con gli alloantigeni possano essere identificati nell'ambito dei repertori specifici per i patogeni. Attualmente (15) abbiamo ottenuto i seguenti risultati preliminari e abbiamo stabilito il range di dose sicuro: 31 riceventi di trapianto aploidentico hanno ricevuto una singola dose di terapia adottiva (21 hanno ricevuto cellule specifiche contro CMV e 10 cellule specifiche contro Aspergillus) compresa tra 105 e 3x106/Kg cellule al giorno +20 dopo il trapianto. Nessuno dei 30 pazienti che hanno ricevuto fino a 106 cellule/Kg ha sviluppato GVHD o altra tossicità. Nel gruppo di controllo di 23 riceventi, che non hanno ricevuto terapia adottiva, cellule T specifiche verso CMV e Aspergillus sono state individuate solo 9-12 mesi dopo il trapianto, in frequenza molto bassa (tramite LDA). La terapia adottiva è stata associata invece con un veloce recupero (2-3 settimane) delle cellule T specifiche in frequenze vicine a quelle normali e rimaste stabili a lungo termine (monitorate per circa 1 anno). Disegno sperimentale Dopo che il consenso informato sarà stato ottenuto dai donatori e dai riceventi e lo studio sarà stato approvato dall'Internal Review Board (NIH Federal-Wide Assurance no.00005268), procederemo come segue: • Raccolta delle cellule. I donatori saranno sottoposti a leucoferesi e plasmaferesi per raccogliere cellule e siero per la terapia adottiva. • Preparazione delle cellule. Giorno 1. PBL/DC sono stimolate con RNA di Aspergillus e antigeni CMV irradiati con 2 Gy. • Le cellule stimolate vengono piastrate in piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 2x106 cellule/ml.. • Altro PBL dallo stesso donatore è aggiunto a 48 pozzetti per ogni dose cellulare a concentrazioni scalari di 50000 cellule per pozzetto fino a 500 cellule per pozzetto. • Giorno 14. IL-2 viene aggiunta. • Quando 3-4 o più pozzetti (circa 3x105 cellule) sono state ottenute da ogni clone, i cloni sono analizzati per alloreattività verso l'ospite. Ogni clone viene diviso in tre aliquote 1) per individuare alloreattività contro cellule irradiate del ricevente, 2) un controllo negativo contro cellule autologhe irradiate, 3) un controllo dell'abilità del clone di proliferare in risposta a anti-CD3 o PHA. Dopo tre giorni, le cellule sono stimolate con H3-timidina per 6 ore. • Il criterio da soddisfare per infondere le cellule è l'assenza di reattività in vitro agli alloantigeni dell'ospite tramite MLR. Nelle condizioni di cultura di cui sopra, i cloni mostrano un pattern di produzione di citochine di tipo 1, caratterizzato da alta produzione interferone-gamma, che non ha causato reazioni simil allergiche in vivo. • Infusione dei pazienti. Il giorno +15 dopo il trapianto i cloni non alloreattivi all'ospite saranno infusi in un'unica dose di 0.5-1x106/Kg. Questa dose finale non sarà superata perché la sua sicurezza è stata già verificate nei nostri precedenti studi (vedi sopra). • Obiettivi finali. La valutazione dell'avvenuto trasferimento dell'immunità a CMV e Aspergillus fumigatus. • Monitoraggio. A partire da due settimane dopo l'infusione di cloni specifici contro CMV e Aspergillus e successivamente a intervalli mensili per 1 anno, saggi di diluizione limite di cellule T proliferanti, ELISPOT e ELISA permetteranno la valutazione della frequenza di, e delle citochine prodotte da, cellule T specifiche per Aspergillus. L'antigenemia di CMV e Aspergillus Galactomannan sarà usata per monitorare questi pazienti. Nei pazienti con malattia da CMV documentata o aspergillosi invasiva, evidenze di efficacia clinica saranno ricavate dai parametri standard microbiologici e clinici. Obbiettivo 3. Sperimentare l'uso delle cellule NK alloreattive come parte del regime di condizionamento al trapianto incompatibile con cellule T in modelli di trapianto murini Sperimentare il condizionamento basato su cellule NK per ottenere protezione dalla GVHD e consentire trapianti incompatibili con cellule T al fine di ridurre l'incidenza della mortalità infettiva dopo trapianto. Overview e dati preliminari Abbiamo dimostrato che quando le cellule NK alloreattive sono somministrate come parte del regime di condizionamento al trapianto, esse eliminano le cellule APCs, impedendo in questo modo la presentazione degli antigeni dell'ospite alle cellule T del trapianto. Come è noto, questo è il passaggio cruciale che inizia le reazioni GVH. La GVHD è riportata come la maggiore causa di danno timico e come ostacolo importante al recupero immunitario dopo il trapianto. I nostri dati prodotti nel topo mostrano che il condizionamento basato su cellule NK alloreattive consente il trapianto incompatibile con cellule T senza causare la GVHD e senza necessità di immunosoppressione dopo trapianto per controllare la GVHD. Le cellule NK alloreattive nel condizionamento al trapianto hanno garantito un effetto protettivo dalla GVHD tale da consentire l'infusione sicura di una dose altrimenti letale di cellule T allogeniche. Dunque noi ipotizziamo che a) il recupero della competenza immunologia possa essere migliorata dall'alto numero di cellule T mature nel trapianto che non sarebbero antagonizzate dalla profilassi per la GVHD e che conseguentemente si potrebbero espandere facilmente, e b) la funzione del timo possa essere preservata dal momento che non ci sarebbe GVHD timica. Disegno sperimentale La valutazione dell'immunità ai patogeni nel topo dopo un challenge infettivo sarà utilizzata per confrontare TMO incompatibile standard privo di cellule T e TMO incompatibile con cellule T preceduto dal condizionamento basato su cellule NK. La documentazione del recupero dell'immunità funzionale sarà basata sulla capacità del topo di sviluppare una risposta protettiva e di memoria dopo vaccinazione con un ceppo vivo non virulento di Candida albicans. Animali di controllo non vaccinati sviluppano candidiasi sistemica invasiva e soccombono rapidamente al ceppo di candida virulento, ma rispondono all'infusione del ceppo non virulento di candida sviluppando una robusta protezione contro la candidiasi potenzialmente invasiva data dal ceppo virulento. Infatti, quando sono poi iniettati con il ceppo virulento, sono in grado di eliminare il patogeno e sopravvivere. Dopo il trapianto MHC disparato convenzionale, che richiede irradiazione letale e un trapianto privo di cellule T, i topi impiegano circa 2 mesi per recuperare la loro abilità di rispondere al vaccino. Questo è peraltro un modello molto stringente e anche molto realistico del challenge infettivo a cui gli individui sono soggetti dopo trapianto. Il primo passo è dimostrare che i trapianti incompatibili con cellule T senza GVHD che, come abbiamo discusso, sono resi possibili da regimi di condizionamento basati su cellule NK, conferiscono ai topi riceventi l'abilità di rispondere velocemente nel modello di vaccinazione/infezione con Candida albicans. Il passo successivo è determinare i relativi contributi delle cellule T mature date con il trapianto e proliferate in periferia e delle cellule T prodotte nel timo in vivo dalle cellule staminali trapiantate. I nostri risultati preliminari suggeriscono che: I topi che ricevono TMO incompatibile standard privo di cellule T sono estremamente suscettibili a infezioni precoci dopo trapianto e possono soccombere persino a Candida di bassa virulenza. Anche quando sopravvivono a infezioni di bassa virulenza essi non sono in grado di sviluppare l'immunità cellulare T specifica e possono morire in seguito a challenge di alta virulenza. I topi che ricevono condizionamento basato su cellule NK e TMO incompatibile con cellule T sopravvivono a infezioni precoci da Candida. Successivamente essi sono in grado di sviluppare una risposta protettiva di memoria che gli consente di sopravvivere a challenge con Candida ad alta virulenza. Inoltre analisi preliminari della cinetica del recupero di cellule T e DC originatesi dalle cellule staminali trapiantate mostrano che queste tendono ad essere più veloci dopo TMO con cellule T e basato su condizionamento con NK che dopo TMO privo di cellule T. Analisi preliminari della composizione cellulare del timo e dell'architettura tissutale su topi sottoposti a sperimentazione e di controllo mostrano che il condizionamento con cellule NK seguito da TMO con cellule T non altera il numero totale di timociti o risulta in modificazioni morfologiche che sono tipiche della GVHD timica, cioè perdita di demarcazione cortico-midollare, alterazioni nella composizione e nell'orientamento dello stroma epiteliale, e involuzione timica generale. L'analisi dello sviluppo della linea αβ-TCR intratimica ha dimostrato progressione normale della maturazione da timociti immaturi a cellule T fenotipicamente mature intratimiche. Anche l'esame della relativa distribuzione di tutte le sottopopolazioni timocitarie non ha rivelato nessuno dei cambiamenti comunemente osservati con GVHD timica acuta, cioè perdita di timociti doppiamente positivi e incremento sia nelle cellule T mature derivate dal midollo osseo del donatore che dei precursori immaturi. Queste prime indicazioni supportano le nostra ipotesi che il condizionamento basato su cellule NK per TMO incompatibile T-repleto possa essere una strategia sicura per consentire la terapia adottiva e la resistenza precoce all'infezione post trapianto e risposte di memoria protettive a challenge infettivi, senza mettere in pericolo la ricostituzione delle cellule T del timo dopo trapianto aploidentico di cellule staminali emopoietiche.