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Programma di ricerca
Interazioni tra immunità innata ed immunità adattativa: dalla biologia alla clinica
Università di riferimento
Università degli Studi di FIRENZE -
MEDICINA INTERNA - FIRENZE(FI)
Responsabile dell'Unità di ricerca
Gianfranco DEL PRETE
Descrizione
Scopo del progetto è studiare le interazioni fra APC e cellule T nella regolazione della risposta immune. In particolare sarà studiato il ruolo di nuove molecole (Imidazochinoline, Imidazochinoline side chain-modificate e purine modificate) che possono modulare attraverso i Toll-like receptors (TLRs) la risposta immune innata e quella adottiva. Lo studio si articolerà in 3 sezioni dedicate a: A) definire gli effetti di Imidazochinoline (IM), dei loro derivati modificati (IMD) e di adenine (od adenine modificate) (MA) sulle cellule dell'immunità innata, B) svelare la potenziale attività immunomodulatoria di IM, IMD ed MA su cellule immunocompetenti, C) saggiare la potenziale adiuvanticità di IM, IMD ed MA in risposte linfocitarie T antigene-specifiche. Sezione A. Effetti di Imidazochinolines (IM), derivati di Imidazochinoline (IMD) ed adenine (od adenine modificate)(MA) su cellule dell'immunità innata. Come cellule dell'immunità innata si useranno APC (monociti e cellule dendritiche derivate in vitro) e cellule NK. Questa sezione è suddivisa in 5 punti: A.1. Selezione di IM, IMD ed MA stimolatorie. Le IM R-837 e R-848 sono disponibili in commercio. IMD ed MA saranno sintetizzati nel Dipartmento di Chimica Organica dell'Ateneo fiorentino. Verranno analizzate per prime IMD ed adenine modificate sulle catene laterali. Come controllo positivo si userà CpG-ODNs già noto quale ligando sintetico di TLR con azione specifica sulle APC. Per stabilire l'attività stimolatoria dei composti sulle APC cellule CD14+ purificate mediante MACS saranno stimolate in assenza ed in presenza di concentrazioni diverse di IM, IMD o MA per valutare: i) la produzione di citochine pro-infiammatorie e modulatorie (IFN-a, IL-6, IL-1a/b, IL-1Ra, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNF-a), ii) la produzione di chemochine (CCL22, CCL5, IL-8, CCL3 and CCL4, CXCL10) mediante ELISA, real-time PCR ed analisi intracitofluorimetrica in singole cellule, iii) la modulazione di molecole di superfice co-stimolatorie (MHC classe II, CD80, CD86, CD40, recettori per chemochine). Le cellule dendritiche (DCs) saranno usate come bersaglio per valutare le capacità immunostimolatorie dei composti. Le DCs derivate da monociti saranno ottenute da cellule CD14+ del sangue periferico di donatori normali in presenza di GM-CSF ed IL-4 o da popolazioni CD34-arricchite di cordone ombelicale in presenza di GM-CSF, IL-3, Flt-3L con o senza IL-4. Saranno anche analizzate DCs plasmacitoidi (PDC) dopo purificazione con MACS mediante l'uso di un anticorpo monoclonale anti-BDCA2. Le DCs saranno indotte a maturazione in vitro con i classici stimoli (LPS, TNF-b) a confronto con IM, IMD o MA in maniera dose-dipendente e quidi saranno misurate la produzione di citochine o chemochine o l'induzione di marcatori di membrana. La capacità di presentazione dell'antigene sarà valutata con una coltura mista linfocitaria usando cellule T allogeniche come responders o con risposte T specifiche ad antigeni solubili o peptidi. A.2 Segnali via TLRs e quadri transcrizionali di IM, IMD ed MA immunostimulatori. Il segnale via TLR9 da parte di CpG ODNs attiva JNKK1, JNK1/2 e p38 in macrofagi e DCs di topo. Le vie di attivazione cellulare dipendenti da TLR9 e TLR7 condividono le stesse molecole adattatorie MyD88, IRAK e TRAF6 coinvolgenti cJun e p38MAPK e da altimo l'attivazione dei fattori di trascrizione NFkB e AP-1. Sebbene sia noto che IM è un ligando sintetico di TLR7 (nell'uomo anche di TLR8), le modifiche "side-chain" nell'IMD potrebbe mutare il quadro di riconoscimento dei TLRs. Sarà perciò valutata l'attivazione di NF-kB in colture di cellule CD14+ o DCs condizionate da IMD e da MA e verrà analizzato mediante tecnica di microarray (affimetrix Microarray) un più vasto pannello trascrizionale. Mentre la guanosine può legare TLR7, nulla si sà sui possibili siti di legame delle adenine modificate. Verranno perciò ottenuti trasfettanti stabili di HEK-293 per TLR7, TLR8 e TLR9 in cui misurare l'attivazione e la produzione di citochine pro-infiammatorie in presenza di adenine, MA od IM, nonchè di CpG-ODNs come controllo. A.3. Effetti di IM, IMD ed MA sulla differenziazione di DCs. Buone quantità di DCs immature umane si possono ottenere con la purificazione di cellule CD14+ o CD34+ e successiva coltura in presenza di differenti miscele di citochine. Sebbene alcuni ligandi di TLRs inducano maturazione di iDC, non è noto se IM ed i suoi derivati possono influire sulla differenziazione di tale populazione cellulare. Saranno perciò ottenute DCs CD14- or CD34-derivate in assenza od in presenza di diverse dosi di IM o di CpG-ODNs (controllo). Al termine delle colture si valuteranno: l'efficienza del sistema di coltura; il ritmo di morte/apoptosis delle cellule con annessina V ed assunzione di ioduro di propidio; la possibile modulazione dell'espressione in membrana di CD14, CD83, CD1a, CD80, CD86 and MHC class II con analisi citofluorimetrica; modificazioni nell'attività di endocitosi con citofluorimetria per BSA marcata con FITC; variazioni nella capacità di presentazione in coltura mista con linfociti T allogenici come responders. A.4. Possibili regolazioni negative da parte di IMD. In alcuni modelli sperimentali una forte stimolazione del sistema immunitario via TLRs produce effetti dannosi che assomigliano a quelli della sepsi a causa dell'eccessiva produzione di TNF-a. Per contro, l'inibizione di p38 porta ad una riduzione di TNF-a e di IL-12. Si può ipotizzare che alcuni composti sintetici modificati nella loro struttura chimica pur mantenendo la capacità di legare TLRs possano funzionare come regolatori in senso negativo. Per stabilire se alcuni degli IMD sintetizzati possano esercitare un antagonismo recettoriale, monociti purificati o DCs CD14- or CD34-derivate saranno stimolati con IM in assenza ed in presenza di diverse dosi di IMD e si valuterà l'inibizione della produzione di citochine o dell'espressione di molecole di attivazione. A.5. Effetti diretti di IM, IMD ed MA sulle cellule NK. In alcuni modelli animali le cellule NK possono essere attivate indirettamente da alcuni ligandi di TLR indotti da citochine in APCs e cellule B. Per affrontare questo punto con cellule umane, cellule NK purificate con MACS saranno studiate per la loro risposta proliferativa, produzione di IFN-g ed attività citotossica dopo stimolo con IM, IMD o MA a confronto con CpG-ODNs. Eventuali effetti indiretti potranno essere valutati aggiungendo anticorpi neutralizzanti citochine (anti-IL-12, anti-IL-15, anti-IL-18) o molecole di superfice di popolazioni cellulari contaminanti (anti-BDCA2, anti-BDCA4). Sezione B. Potenziale attività immunomodulatoria di Imidazochinoline (IM), Imidazochinoline-derivati (IMD) ed adenine (o adenine modificate)(MA) su cellule immunocompetenti (cellule B, cellule T antigene-specifiche e cellule T TCRgd). B.1 Effetti di IM, IMD ed MA con attività stimolatoria su cellule B normali. L'attività di IM, IMD selezionati e M sarà testate su linfociti B a riposo ottenuti per MACS da sangue di donatori normali. Sequenze di CpG-ODN con nota attività sulle cellule B saranno usati come controllo. Si valuterà l'attivazione in vitro (ciclo cellulare, espressione di molecole di superfice, produzione di citochine e chemochine), la proliferazione e la differenziazione (produzione di anticorpi) usando differenti dosi dei composti. Possibili effetti potenziati di contaminanti cellulari (es. PDC) saranno esclusi eliminando le DCs con anticorpi monoclonali specifici (anti-BDCA4 or anti-BDCA2). Studieremo gli effetti di IM, IMD ed MA su linfociti B attivati indotti da stimoli T-dipendenti (PWM) od indipendenti (anti-CD40 più anti-IgM, Cowan Staph, Protein A-Sepharose) e citochine esogene (IL-4, IL-6, IL-10). Poichè alcuni ligandi di TLRs come CpG-ODNs inibiscono la produzione di IgE da parte di cellule B inducendo l'espressione di t-Bet, cellule B derivate dal sangue di donatori allergici saranno posti in coltura in assenza od in presenza dei composti per 10 gg ed I livelli di IgE nei surnatanti saranno misurati con ELISA sia in colture non stimolate (produzione spontanea) che stimolate con IL-4. Saranno inoltre misurati i livelli di IgG, IgA ed IgM nelle colture. B.2 Possibili effetti di IM, IMD ed MA sulla maturazione e differenziazione di cellule B leucemiche. I linfociti della leucemia linfatica cronica B (B-CLL) sono cellule B a riposo che vanno incontro ad apoptosis in vitro e sono incapaci di stimolare adeguatamente un'efficiente risposta T, nochè di differenziare correttamente in plasmacellule. E' stato osservato tuttavia che CpG-ODNs con specifiche sequenze sono in grado di stimolare cellule B-CLL ad entrare in ciclo, ad attivarsi, a differenziare ed a stimolare risposte da parte di cellule T. Uno degli scopi dello studio è stabilire se IM, IMD ed MA hanno un potenziale terapeutico riuscendo a stimolare i B-CLL. Tali cellule saranno purificate con tecnica MACS ed anticorpi a.CD19 o a.CD5, valutando primariamente con real-time PCR l'espressione di TLRs. Le B-CLL saranno incubate con diverse dosi di IM, IMD od MA usando CpG-B ODNs come controllo positivo, valutando: la stimolazione della proliferazione di B-CLL; l'entrata in ciclo cellulare (sistema CFDA-SE); l'incremento di molecole co-stimolatorie (CD80, CD86, CD40, MHC Classe II); il grado di espressione di CD20 in superfice che sarebbe potenzialmente utile per la terapia con Rituximab; l'aumentata capacità di B-Cll stimolate ad indurre risposte proliferative da parte di linfociti T allogenici; l'inibizione di recettori chemochinici, quali il CXCR3, che si pensa venga utilizzato dai B-CLL per la diffusione nell'organismo; la differenziazione di B-CLL in plasmacellule secernenti anticorpi valutandone l'isotipo, la capacità di "switch" isotipico e la modulazione della produzione di fattore reumatoide nelle cellule CD5+ ; l'incremento di attività citotossica di Rituximab radiomarcato nei cocntronti di B-CLL stimolati con IM, IMD o MA; ed infine la produzione di citochine (IL-6, TNF-a, IL-10). B.3 Attività modulatoria di IM, IMD ed MA su linfociti T 'naive', 'memory' e g/d. Cellule T policlonali attivate CD4+CD45RO derivate da sangue di cordone ombelicale possono essere modulate in vitro se poste in coltura con IL-4 od IL-12, inducendo rispettivamente un profilo polarizzato Th2 o Th1. La modulazione funzionale si associa all'espressione preferenziale di LAG3 e di CCR5 nelle cellule T producenti IFN-g e di CRTH2, CCR4, CCR8 nei T producenti IL-4. Verranno esplorati possibili effetti diretti esercitati da IM, IMD ed MA su linfociti T 'naive'. Verranno quindi esaminati gli effetti su linfociti T g/d sia in linee T antigene-specifiche sia in cellule T purificate a/b che g/d le quail saranno analizzate sia in stato di riposo sia dopo attivazione con anti-CD3 od attivatori policlonali in presenza di IL-2 e dei composti immunomodulanti. B.4 Modulazione delle cellule T regolatorie da parte di IM, IMD ed MA. Alcune cellule T regolatorie come le Treg CD3+CD4+CD25+ che si trovano nel sangue e nel timo umano, contribuiscono alla tolleranza immunologica ed influenzano i processi di autoimmunizzazione. Sebbene siano solo il 5% dei T circolanti, le cellule Treg inibiscono svariate funzioni delle cellule T CD4+CD25- (Th1 and Th2) ed esprimono CTLA4, CCR4 e CCR8. Cellule Treg CD4+CD25+hi purificate con MACS dal sangue periferico saranno poste in cocoltura con cellule CD4+CD25- ed APC allogeniche in assenza od in presenza dei composti in esame. Si valuterà la possibile abrogazione dell'effetto regolatorio delle cellule Treg analizzando le citochine pro-infiammatorie (IFN-a, IL-12, IL-15 e IL-18) o le chemochine (CXCL10, CCL22) prodotte dalle APC o la modulazione di nuove molecole di membrana. Si cercherà anche di individuare i fini meccanismi inibitori degli effetti delle cellule Treg. Sezione C. Potenziale adiuvanticità di Imidazochinoline (IM), Imidazochinolino-derivati (IMD) ed adenina (od adenine modificate)(MA) nelle risposte linfocitarie T antigene-specifiche. C.1 Immunoregolazione di risposte T antigene-specifiche. Si intende studiare la potenziale capacità di IM, IMD ed MA di modulare risposte antigene-specifiche da parte di cellule effettrici Th. Si analizzarà la capacità dei composti in esame di indurre risposte Th1 (invece che Th2) ad allergeni. Allo scopo saranno ottenuti blasti T allergene- od aptene-specifici dal sangue di donatori allergici mediante stimolazione in vitro dei linfociti con Der p1, Lol p 1 o beta-lattamici (penicillina, ampicillina, amoxicillina) in assenza od in presenza di differenti dosi di IM, IMD ed MA o di IL-12 ricombinante come controllo positivo. Dei blasti T si valuterà la capacità di produrre citochine mediante citofluorimetria e tests ELISA, nonchè l'espressione di recettori per chemochine. Linee T specifiche per antigeni batterici (streptokinasi) generate dagli stessi donatori faranno da controllo. Inoltre, linee T allergene-specifiche saranno generate in presenza dei composti in esame e di anticorpi neutralizzanti anti-citochine e/o anticorpi bloccanti recettori per citochine (anti-IL-12, anti-IL-15, anti-IL-18, anti-IFN-a, ed anti-IFN-gR) allo scopo di verificare se l'attività modulante dei ligandi sintetici di TLR sia mediata dall'induzione di particolari citochine prodotte dalle cellule dell'immunità innata. Allo scopo di stabilire se cellule Th2 allergene-specifiche rappresentino realmente la popolazione cellulare prevalentemente influenzata dai composti, si procederà a sorting di cellule CRTH2+ dal sangue periferico di donatori allergici che saranno poste in coltura con gli appropriati allergeni ed APC autologhe in assenza o presenza di differenti concentrazioni di IM, IMD od MA, procedendo quindi all'analisi come sopra descritto. C.2 Coniugazione di IM, IMD od MA ad antigeni per generare potenziali agenti immunoterapeutici in vitro. Nel modello murino i risultati dell'immunizzazione con allergeni legati ad adiuvanti, quali CpG-ODNs, hanno indotto a pensare che questa procedura possa essere un metodo efficace per influire sulle risposte Th2 allergene-specifiche sia in vitro che in vivo. La reattività dei coniugati allergene/adiuvante con gli specifici anticorpi IgE è fortemente ridotta, abbassando il potenziale anafilattogeno dell'allergene in vivo. Sebbene i dati sperimentali siano incoraggianti nei modelli animali, non è mai stata ottenuta analoga evidenza in vitro nell'uomo. Perciò la coniugazione di adiuvanti efficienti ad antigeni od allergeni può rappresentare uno strumento innovativo per nuove strategie immunoterapeutiche che conserverebbero una sufficiente immunogenicità unitamente alla riduzione degli effetti negativi legati ad un'eccessiva attività pro-infiammatoria. Questa parte dello studio affronterà anche il quesito se sia possible ottenere stabili coniugati fra allergeni ricombinanti ed i composti immunostimolatori IM, IMD od MA che possano mantenere la capacità di modificare il fenotipo funzionale delle cellule T allergene-specifiche T in vitro. I coniugati fra composti immunostimolatori e Der p 1 purificato o penicillina saranno sintetizzati dal Dipartimento di Chimica Organica dell'Ateneo fiorentino. A confronto si useranno IM, IMD ed MA ed allergeni non coniugati. Un secondo approccio sperimentale prevede la co-veicolazione di IM, IMD od MA con liposomi oppure l'assobimento a particelle cationiche di poly(lactide-co-glycolide) allo scopo di stabilire se un più diretto ed efficace condizionamento delle APC sia ottenibile con i coniugati o con semplici miscele dei composti. Per questi scopi si useranno i modelli in vitro riportati ai punti B.4 e C.1. Infine, la capacità dei coniugati di legare in vitro le IgE allergene-specifiche sarà valutata misurando la loro capacità di indurre liberazione di istamina o degranulazione dei basofili in vitro.
